苦瓜多糖微波辅助提取工艺及其抗氧化活性

张伟丰，王 亮

（新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830066）

苦瓜（Momordica charantia L.）为葫芦科苦瓜属一年生蔓性草本植物的果实，又名凉瓜、癞瓜等[1].苦瓜中含有多种化学成分，诸如苦瓜素、苦瓜皂苷、苦瓜凝集素、多糖等，国内外对苦瓜多糖（Polysaccharides from Momordica charantia L.，MCLP）研究较少，主要集中在苦瓜多糖的热水提取[2]、酶法协同提取[3]、降血糖活性[4]、抗肿瘤及免疫活性[5]等初步研究方面，但关于微波协同辅助提取苦瓜多糖工艺鲜见报道.为此，本文探讨苦瓜多糖微波辅助提取工艺，并探讨其抗氧化活性，旨在为苦瓜多糖的工业化生产提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦瓜（市售）；乙醇、苯酚、浓硫酸、盐酸、FeSO4、水杨酸等均为分析纯；邻苯三酚、葡萄糖（中国医药集团上海化学试剂公司）；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）（Sigma公司）

1.2 主要仪器

200 g手提式高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；G2X-GFC型电热恒温鼓风干燥箱（上海博泰实验设备有限公司）；TGL-16GA型冷冻高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵（上海预康科教仪器设备有限公司）；RE-52X型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；LGI-10冷冻干燥机（宁波新芝生物股份有限公司）；722可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）.

1.3 方法

1.3.1 苦瓜的预处理

将苦瓜洗干净去籽之后，切成薄片，置于干燥箱中70℃干燥48 h，粉碎待用.

1.3.2 苦瓜多糖提取工艺流程

苦瓜粉→微波辅助提取→离心→上层清液→浓缩→粗多糖溶液→醇析→沉淀→干燥→苦瓜多糖.

1.3.3 多糖含量的测定及提取率计算

多糖含量采用改良的苯酚-硫酸法[6]，提取率计算按照下列公式：

多糖提取率=粗多糖质量/原料质量×100%

1.3.4 苦瓜多糖微波提取工艺的单因素实验

（1）液料比对苦瓜多糖提取率的影响

准确称取3 g苦瓜粉末，在微波功率为50 W，提取时间为10min的条件下，考察不同液料比（20，30，40，50，60）（mL/g）对苦瓜多糖提取率的影响.

（2）微波功率对苦瓜多糖提取率的影响

准确称取3 g苦瓜粉末，在液料比20：1，提取时间为10 min的条件下，考察微波功率（40，50，60，70，80 W）对苦瓜多糖提取率的影响.

（3）提取时间对苦瓜多糖提取率的影响

准确称取3 g苦瓜粉末，在料液比20：1，微波功率为50 W的条件下，考察提取时间（5，10，15，20，25 min）对苦瓜多糖提取率的影响.

1.3.5 苦瓜多糖微波辅助提取的正交试验

在上述单因素试验的基础上，设计微波功率（A）、液料比（B）和提取时间（C）的3因素3水平正交试验，以苦瓜多糖的提取率为指标进行正交试验，从而选出最佳水平的组合，得出苦瓜多糖微波辅助提取法的最佳工艺参数.

1.3.6 苦瓜多糖的抗氧化活性

（1）对羟基自由基（·OH）的清除作用[7]

以8.8 mmol/L H2O21 ml、9 mmol/L FeSO4l ml、9 mmol/L水杨酸-乙醇1 ml、不同浓度的多糖溶液1 ml构成反应体系，最后加H2O2启动反应，在37℃反应0.5 h，以蒸馏水为参比，在510 nm下测量各浓度的吸光度.考虑到多糖本身的吸光值、以9 mmol/L FeSO4l ml、9 mmol/L水杨酸-乙醇1 ml、不同浓度的多糖溶液1 ml和1 ml蒸馏水作为多糖的本底吸收值，按照下列公式计算清除率：

清除率=[1-（AX-AX0）/A0]×100%

其中，A0：空白对照液的吸光度；AX：加入多糖溶液后的吸光度；AX0：不加显色剂H2O2多糖溶液本底的吸光度.

（2）对超氧自由基（O2－）的清除作用[8]

取4.5 ml 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）和4.2 ml蒸馏水，混匀后在25℃水浴中保温20 min，取出后立即加入到25℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚0.3 ml（以10 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCl溶液），迅速摇匀后倒入比色杯，325 nm下每隔30 s测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加，按照下列公式计算清除率.

清除率=（△A0－△A）/△A0×100%

其中，△A0：邻苯三酚的自氧化速率；△A：加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率.

（3）对DPPH自由基的清除作用[9]

取2 mL不同浓度的样品多糖溶液与0.1 mmol/L DPPH自由基溶液2 mL，充分摇匀后在室温下静置30 min，在517 nm处测定吸光度，按照下列公式计算清除率：

清除率=[1-（AX-AX0）/A0]×100%

其中，A0：2 mL乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度；AX：2 mL样品液加2 mL DPPH溶液的吸光度；AX0：2 mL样品液加2 mL乙醇的吸光度.

2 结果与分析

2.1 液料比对苦瓜多糖提取率的影响

由图1可以看出，苦瓜多糖的提取率随溶剂的增加而增加，当液料比大于40：1（mL/g）后，多糖提取率的增加趋势较为平缓.从节约原料和溶剂的角度考虑，选用液料比40：1（mL/g）比较合适.

图1 液料比对苦瓜多糖提取率的影响

2.2 微波功率对苦瓜多糖提取率的影响

由图2可知，苦瓜多糖提取率随着微波功率的升高先增加后减小，当微波功率达到60 W时，多糖提取率出现峰值.这可能是因为功率越高，温度越高，水溶性多糖的扩散速度就越快，使有效成分更快浸出.但在微波功率大于60 W时，多糖的提取率有所降低，可能是因为功率的升高导致温度的升高，使苦瓜中其他的水溶性物质一起浸出，从而抑制了多糖的浸出，导致多糖的提取率下降.因此，微波功率选择60 W为宜.

图2 微波功率对苦瓜多糖提取率的影响

2.3 提取时间对苦瓜多糖提取率的影响

从图3中可以看到，随着提取时间的增加，苦瓜多糖的提取率变化情况是先增加后减小，提取时间达到15 min时，多糖提取率出现又一个峰值.其中的原因可能是苦瓜多糖的提取率与提取时间有很大关联，时间过短，多糖溶解不充分，当提取时间超过15 min时，多糖的提取率又逐渐减小，这说明提取时间过长可能会破坏多糖的结构而导致提取率降低.因此，提取时间选择15 min.

2.4 提取工艺的优化

在单因素实验研究结果的基础上，确定液料比、微波功率和提取时间为苦瓜多糖提取率的主要影响因素，设计L9（33）正交试验，设计表见表1，实验结果见表2.

从表2中的极差R值能够看出，三个因素对苦瓜多糖提取率的影响程度为B＞A＞C，并且液料比影响程度最大，其次是微波功率，影响最小的是提取时间.所以最佳提取组合条件为A2B3C3，即液料比为50：1（mL/g），微波功率60 W，提取时间为20 min.在最佳工艺条件下微波辅助提取苦瓜多糖的提取率为10.05%.

图3 提取时间对苦瓜多糖多糖提取率的影响

2.5 苦瓜多糖的抗氧化活性

2.5.1 对羟基自由基的清除作用

苦瓜多糖对羟基自由基的清除作用见图4，从图4可以看出，在供试的浓度范围内，苦瓜多糖具有显著的清除·OH的能力，清除效果随着多糖浓度的增加而上升，并且有一定的量效关系.多糖浓度为2.5 mg/mL时清除率最高，达到63.68%，表明苦瓜多糖清除羟基自由基能力较高.

2.5.2 对超氧阴离子自由基的清除作用

苦瓜多糖对超氧阴离子自由基的清除作用见图5，从图5可以看出，在供试的浓度范围内，苦瓜多糖具有显著的清除超氧阴离子的能力，随着多糖浓度的增加，清除超氧阴离子的作用不断增强，且有一定的量效关系.当浓度达到2.5 mg/mL时，清除率达到59.24%，表明苦瓜多糖清除超氧阴离子能力较高.

表1 苦瓜多糖提取工艺的正交试验因素与水平

图4 苦瓜多糖对羟基自由基的清除作用

图5 苦瓜多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

2.5.3 对DPPH自由基的清除作用

苦瓜多糖对DPPH自由基的清除作用见图6，从图6可看出，在供试的浓度范围内，苦瓜多糖具有显著的清除DPPH的能力，随着多糖浓度的增加，清除DPPH作用不断增强，且有一定的量效关系，当浓度达到2.5 mg/mL时，清除率达到42.54%.

表2 微波辅助提取苦瓜多糖的L9（33）正交试验设计及结果（n=3）

图6 苦瓜多糖对DPPH自由基的清除作用

3 结论

（1）确定微波辅助提取苦瓜多糖的最佳工艺为：液料比为50：1（mL/g），微波功率60 W，提取时间20 min.在最佳工艺条件下微波辅助提取苦瓜多糖的提取率为10.05%.

（2）苦瓜多糖具有较强的清除羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基作用，且随着多糖浓度的增加，清除作用不断增强，具有一定的量效关系.当苦瓜浓度达到2.5 mg/mL时，对羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除率分别达到63.68%、59.24%和42.54%.

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