响应曲面法优化山茱萸多糖提取

戴阳军，曾雅雯，单 康

（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

山茱萸又名蜀枣、鼠矢、鸡足、实枣儿、枣皮等.在我国分布较广，除了分布在长江以北，秦岭等广大中低山丘陵地区，浙江的杭州、河南南阳、陕西汉中等地区也是山茱萸的主产区[1].山茱萸呈生理碱性，具有降血糖、补益肝肾、固精缩尿等多种功能，山茱萸在国内运用较多.早在古代，人们就将山茱萸运用到一些病理的治疗中.传统中药中常将其与枸杞子、杜仲、熟地等多种药材结合，专治肝肾不足、耳鸣腰酸、头晕目眩等.山茱萸多糖具有抗氧化和清除自由基等方面的作用.

对于山茱萸的研究，国内较多.易晓卫等[2]曾就山茱萸的营养价值及市场价值做出报导；闻雅岚等[3]研究了山茱萸发酵酒的生产工艺；徐怀德等[4]研究了澄清的山茱萸保健饮料工艺；胡园园、李豪等[5-6]对山茱萸提取多糖的工艺展开了多项研究.本试验在前人研究提取山茱萸多糖的基础上，运用响应曲面优化试验设计得到微波萃取山茱萸多糖的最佳方案.

1 材料

1.1 原料与试剂

原料：山茱萸（陕西佛坪袁大头土特产食品公司）、白砂糖、酵母（常熟市常客隆超市）等.试剂：乙醇、苯酚、硫酸（均为分析纯级）等.

1.2 仪器设备

LY-3L微波辅助萃取仪器：上海隆誉微波设备有限公司；DZ-400/2ES真空包装机：华联机械集团有限公司；HHT4-YX-280D不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅：北京中西远大科技有限公司；LP502B电子天平：上海越平科学仪器有限公司；BCD-196KF冰箱：青岛海尔股份有限公司；722紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；LD4-ZA离心机：北京医用离心机厂；RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器公司；WGL-230 B电热鼓风干燥箱：南京远拓科学仪器有限公司等.

2 方法

2.1 工艺流程图

原料选择→清洗、沥干→发酵→干燥→粉碎→加水→微波辅助萃取→过滤→配料→浓缩.

2.2 操作要点

2.2.1 发酵

利用酵母在生产过程中消耗单糖及双糖等寡糖来提高山茱萸多糖纯度，此外，发酵过程消耗有机酸，有益于山茱萸去酸去涩.发酵温度为38℃，酵母添加量为1%，发酵时长为90 min.

2.2.2 干燥

鲜果易受到季节性影响，干燥之后使得山茱萸便于长期加工生产.采用恒温烘箱对山茱萸进行烘干，烘干温度为65℃，烘干时长根据烘干数量决定.烘干标准以山茱萸硬度合适，颜色暗红为准.

2.2.3 微波辅助萃取

微波辅助萃取与实验所得多糖提取率有较大联系，因此微波辅助萃取过程需进行相关工艺优化.

2.3 山茱萸多糖萃取工艺优化

对料液比、微波时长及微波功率这三项因素进行单因素试验.根据单因素对山茱萸多糖萃取效果的影响，对应项山茱萸多糖萃取率的主要因素进行中心组合试验，以山茱萸多糖提取率为响应值，进行优化分析.

2.3.1 单因素实验

①料液比对山茱萸多糖提取率的影响

分别称取经过预处理的山茱萸粉末5份，每份称取质量为10.0 g，置于三角锥形瓶中.在其他因素不变的条件下，分别按照0.03、0.05、0.07、0.09、0.11的料液比向锥形瓶中添加蒸馏水.80℃水浴30 min，固定微波功率600 W，微波时长为10 min.将萃取所得溶液进行离心分离，取上清液稀释定容，测定溶液的吸光值.并以此为依据，判定料液比对山茱萸多糖提取率的影响.

②微波功率对山茱萸多糖提取率的影响

分别称取经过预处理的山茱萸粉末5份，每份称取量为10.0 g，置于三角锥形瓶中.向锥形瓶中添加250 mL蒸馏水，在80℃条件下水浴30 min.设置固定微波时长为10 min，在其他因素不变的条件下，微波功率分别设定为400，500，600，700，800 W.将萃取所得溶液进行离心分离，取上清液稀释定容，测定溶液的吸光值.并以此为依据，判定微波功率对山茱萸多糖提取率的影响.

③微波时长对山茱萸多糖提取率的影响

分别称取经过预处理的山茱萸粉末5份，每份称取量为10.0 g，置于三角锥形瓶中.向锥形瓶中添加250 mL蒸馏水，在80℃条件下水浴30 min.设置固定微波功率为600 W，在其他因素不变的条件下，微波时长分别设定为6，8，10，12，14 min.将萃取所得溶液进行离心分离，取上清液稀释定容，测定溶液的吸光值.并以此为依据，判定微波时长对山茱萸多糖提取率的影响.

2.3.2 响应面试验设计

为了确定微波辅助萃取山茱萸多糖的最佳工艺，选出了微波辅助萃取山茱萸多糖影响主要的三因素：料液比、微波功率以及微波时间进行进一步分析.以单因素实验结果为基础，对影响山茱萸多糖提取率的三个因素进行响应面试验.

2.4 山茱萸多糖测定与感官检验

2.4.1 多糖含量的测定

山茱萸多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[7-9].现以葡萄糖为标准品，葡萄糖溶度为横坐标，所测得吸光值为纵坐标.图1为葡萄糖溶液的标准曲线直线图，得到的相应的标准曲线回归方程为：y=12.532x+0.0155，其中R2=0.9931.按照下面方法，计算多糖提取率：

多糖提取率=（多糖质量浓度（mg/mL）×体积（mL）/原料质量（mg））×100%.

图1 葡萄糖标准曲线图

3 结果分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 料液比对微波辅助萃取多糖提取率的影响

由图2可看出，当提取料液比在0.03～0.05时，山茱萸多糖的提取率随着料液比的升高而增加，当料液比达到0.05时，达到最大提取率，当料液比超过0.05时，提取率开始下降.因此选择料液比为 0.04～0.06这一区间.

3.1.2 微波功率对山茱萸多糖提取率影响

由图3中可看出，随着功率的不断增加，提取率呈峰值变化.当功率在400～500 W这一区间时，提取率呈上升趋势；超过500 W，提取率呈下降趋势.当微波功率在500 W时，吸光值达到较高值.比较分析，选择微波功率在500～600 W这一区间.

3.1.3 微波时间对山茱萸多糖提取率影响

由图4可看出，当微波时间在6～8 min时，提取率不断上升，且上升趋势较大；当微波时间在8～10 min时，提取率上升趋势平缓；当微波时间在10 min以上时，提取率持续下降.比较分析，选择微波时间在8～10 min这一区间.

图2 料液比对山茱萸多糖提取率的影响

3.2 响应曲面试验设计结果分析

3.2.1 响应曲面试验设计

以单因素实验为基础，对山茱萸的影响因素进行BBD试验，以山茱萸多糖提取率为响应值.响应面因素水平表所示，响应面设计结果见表1、表2.

分析得到二次多项回归方程为：

Y=+ 12.31-0.82A-0.65B-0.42C + 0.80AB +1.10BC-1.70A2-2.90B2-2.83C2.

继续对所得到的结果进行分析，分析结果如表3所示.

经显著性检验可以看出，回归模型高度显著，相关系数R2为0.9801，说明模型的拟合度好，表明实验值和预测值时间有很好的一致性；调整相关系数adj-R2为0.9082说明山茱萸多糖得率模型能够解释各因素对提取率的影响.本试验中模型失拟项的P＜0.0001，模型失拟项不显著，进一步说明此模型的拟合度良好.变异系数（C.V%）远小于5%表示试验的精确度高，说明模型方程能够较好地反应真实值.综上所述，回归模型拟合程度良好，实验误差小，能够准确分析和预测山茱萸多糖的提取率.

各单因素的P值均远小于0.05，说明各单因素对结果的影响均是显著的；交互项中，AB和BC对于结果的影响是显著的，AC对于结果的影响不显著；二次项对于结果的影响均为极显著.

对结果影响显著的交互项响应曲面图如图5所示：

表1 响应面因素水平表

表2 响应面试验设计与结果

表3 回归模型的方差分析

3.2.2 响应曲面优化试验

对所得结果进一步进行优化，选取多糖提取率为MAX，设置区间为7%～15%，最终得到最佳工艺条件为：料液比为0.05（1：19），微波功率为541.17 W，微波时长为8.87 min.该条件下，多糖提取率理论值为12.51%.按照此条件进行多组优化试验，设置料液比为0.05（1：19），微波功率为541 W，微波时长为8.87 min，提取率为12.34%±0.50，与理论值的误差在5%范围内，说明由此优化的数据真实可靠，具有实际应用价值.

4 结论

通过Box-Behnken响应曲面试验设计得到了微波萃取多糖的最优工艺参数为：料液比为0.05（1：19）、微波功率为541 W、微波时间为8.87 min.在此条件下，多糖得率为12.34%±0.50.通过验证实验所得实际值与模型预测值接近，证明应用响应面法优化山茱萸多糖微波提取工艺是准确可行的，并为山茱萸的进一步研究和工业化生产提供理论依据.

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