附子注射液对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢及骨密度的影响*

裴雅松，唐汉庆，郑豪芬，苏永华，李晓华

(1.右江民族医学院基础医学院，百色 533000；2.广西壮族自治区钦州市中医医院骨科，钦州 535000)

附子注射液对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢及骨密度的影响*

裴雅松1，2，唐汉庆1，郑豪芬2，苏永华2，李晓华1

(1.右江民族医学院基础医学院，百色 533000；2.广西壮族自治区钦州市中医医院骨科，钦州 535000)

目的 观察附子注射液对大鼠去卵巢骨质疏松模型骨代谢及骨密度(BMD)的影响。方法 将60只清洁级Wistar雌性大鼠随机分为假手术组、模型对照组、附子小剂量组、附子中剂量组、附子大剂量组、阳性对照组，每组10只。模型对照组、附子小剂量组、中剂量组、大剂量组、阳性对照组切除卵巢。附子小、中、大剂量组分别给予附子注射液 5，10，20 g·kg-1、阳性对照组给予雌二醇注射液 0.05 g·kg-1，尾静脉注射，假手术组、模型对照组则分别给予同体积0.9%氯化钠溶液。均1次·d-1，连续8周 。检测血清钙(Ca)、磷(P)、BMD、子宫质量指数、骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酐(Cr)、脱氧吡啶啉(DPD)、骨小梁厚度、骨小梁间距。结果 与假手术组比较，模型对照组血清Ca、P水平、骨小梁间距、尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)，而BMD、子宫质量指数、BGP、ALP、骨小梁厚度均显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较，附子大剂量组、阳性对照组血清Ca、P水平、骨小梁间距、尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平均降低(P<0.05 或P<0.01)。而BMD、骨小梁厚度、BGP、ALP显著升高(P<0.01)，且阳性对照组子宫质量指数显著升高(P<0.01)。结论 附子注射液和雌二醇均能改善骨质疏松部分骨代谢生化指标，而大剂量附子注射液对子宫的刺激作用较雌二醇弱，其机制有待探究。

附子注射液；骨质疏松症；卵巢切除术；代谢,骨

骨质疏松症(osteoporosis) 以低骨量、骨组织的微观结构损害为特征，与成骨细胞的骨形成能力及破骨细胞的骨吸收能力之间的失衡有关，各种原因使骨吸收大于骨形成，从而造成骨量的丢失，从骨量减少发展到骨质疏松症是一种起病隐匿的慢性病[1]。中医学根据“肾主骨”的理论，临床多采用补肾生髓方药进行治疗。附子具有补火助阳、温肾散寒等功效，近年研究表明附子功效的发挥与垂体-肾上腺-性腺轴有联系[2-4]。笔者推测附子温肾助阳作用可能通过垂体-肾上腺-性腺轴对骨代谢生化指标及骨结构有一定的影响。大鼠卵巢切除模型与临床绝经后骨质疏松症表现相似度较高，是使用最普遍的实验用骨质疏松症动物模型[5]。因此，笔者建立去卵巢大鼠骨质疏松模型，以附子注射液作为干预药物，观察其对模型大鼠骨代谢生化指标及骨结构的影响，为附子的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级Wistar雌性大鼠60只，体质量205～265 g，右江民族医学院科学实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(桂)2012-0008。实验动物使用许可证号：SYXK(桂)2012A023。分开单笼分笼饲养，室温(23±2) ℃，相对湿度(60±5)%，普通饲料喂养，自由饮水和摄食，实验中对动物的处理遵循相关动物使用伦理学原则。

1.2 药物和试剂 附子注射液(主要成分乌头碱，纯度≥99.2%，国家标准物质网)；戊巴比妥钠(北京化学试剂公司，批号：20110621)；雌二醇注射液(上海通用药业，批号：080401)；血清钙试剂盒(Ca，北京博奥公司，批号：00321101)、磷试剂盒(P，北京博奥公司，批号：120343121)。碱性磷酸酶试剂盒(alkaline phosphatase，ALP，Randox公司，批号：32125)；肌酐试剂盒(creatinine，Cr，Roche公司，批号：65394502)；脱氧吡啶啉试剂盒(deoxypyridinoline，DPD，Metra Biosystem公司，批号：9002347)；骨钙素放免试剂盒(BGP，北京博奥公司，批号：041238)。

1.3 仪器 普利赛斯电子天平(XT220A型，上海麦聚瑞电子仪器有限公司)；生物显微镜(DM1000，莱卡)；电脑快速恒冷冷冻石蜡两用切片机(KD-2258-Ⅵ型，浙江科迪仪器设备有限公司)；高速低温离心机(PK121R型，ALC 公司)；双能X 线骨密度测定仪(DCS-600R型，Aloka，Japan)；智能放免测量仪(SN- 695B 型，上海核所日环光电仪器有限公司)；自动生化分析仪(RTX-90，Beckman公司，USA)。

1.4 动物分组与造模 60只清洁级Wistar雌性大鼠适应性喂养1周，随机分为假手术组，模型对照组，附子小、中、大剂量组，阳性对照组，共6组，每组10只。其中模型对照组和附子小、中、大剂量组、阳性对照组均施行卵巢切除手术[6]：大鼠仰卧位腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg·kg-1麻醉，严格无菌操作下正中腹部切口，钝性分离肌肉组织和腹膜，沿输卵管上行查寻卵巢，应用7号手术缝线在输卵管壶腹处进行结扎，完整切除双侧卵巢后撒上青霉素粉，缝合皮肤，消毒伤口。假手术组手术路径相同，但不切除卵巢，只用镊子轻轻夹出卵巢再送回缝合关腹。术后均连续灌服青霉素3 d，以预防感染。术后均普通饲料喂养，自由饮水。术后恢复2周后附子小、中、大剂量组分别以附子注射液5，10，20 g·kg-1尾静脉注射，阳性对照组则以雌二醇注射液0.05 g·kg-1尾静脉注射，假手术组、模型对照组则分别给予同体积0.9%氯化钠溶液，均每天1次，连续8周。8周后第1天禁食12 h 取材检测。

1.5 血清Ca、P、ALP、Cr、 DPD、BGP测定 处死前分别称各组大鼠体质量，并收集清晨尿液，心脏取血12 mL，4 ℃，2 000 r ·min-1(r=12.4 cm)离心10 min，取上清液，-80 ℃保存。测血清Ca、P、ALP、BGP水平和尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平，分别按照试剂盒说明进行操作检测。

1.6 骨密度(bone mineral density，BMD)测定 应用双能X 线骨密度测定仪和软件进行大鼠左股骨扫描并测定 BMD值。

1.7 子宫质量指数测定 取材前大鼠称定质量，处死后取大鼠子宫，轻压挤出子宫液体，滤纸吸干，称定质量。为避免大鼠个体质量差异对实验的影响，按下列公式计算：子宫质量指数=大鼠子宫质量/大鼠质量。

1.8 骨组织计量分析 大鼠处死后取右股骨，剔除肌肉筋膜组织，称定质量，4%多聚甲醛固定48 h，10%乙二胺四醋酸二钠溶液脱钙 4周，pH7.4的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)冲洗2次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋组织切片，厚度5 μm，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，生物显微镜、自动图像分析仪观察，进行骨组织计量分析，计算骨小梁厚度、骨小梁间距。

2 结果

2.1 大鼠情况 大鼠术后2～3 h完全清醒，可正常进食。48 h后切口无红肿，可正常活动，72 h后切口无感染。全部大鼠2周后切口均Ⅰ期愈合，没有死亡脱落，均纳入统计分析。

2.2 血清Ca、P、BMD、BGP、ALP水平及子宫质量指数测定 与假手术组比较，模型对照组血清Ca、P水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，而BMD、BGP、ALP及子宫质量指数均显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较，附子小剂量、中剂量组Ca、P水平均降低，BMD、BGP、ALP及子宫质量指数均升高，但差异无统计学意义(均P>0.05)。而附子大剂量组Ca、P水平均显著降低，BMD、BGP、ALP显著升高，差异有统计学意义(均P<0.01)。子宫质量指数也升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。与模型对照组比较，阳性对照组血清Ca、P水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，而BMD、BGP、ALP升高，差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)，子宫质量指数显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。附子大剂量组与阳性对照组各项指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平测定结果 与假手术组比较，模型对照组尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)。与模型对照组比较，附子小剂量、中剂量组尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平均下降，但差异无统计学意义(均P>0.05)，而附子大剂量组尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平下降，差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)。与模型对照组比较，阳性对照组尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平下降，差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)。附子大剂量组与阳性对照组各项指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4 大鼠骨小梁厚度、骨小梁间距测定结果 与假手术组比较，模型对照组骨小梁厚度显著减少，骨小梁间距显著增大，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较，附子小剂量、中剂量组骨小梁厚度增大，骨小梁间距减小，但差异无统计学意义(均P>0.05)，而附子大剂量组骨小梁厚度显著增大，差异有统计学意义(P<0.01)，骨小梁间距减小，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，阳性对照组骨小梁厚度增大，差异有统计学意义(P<0.05)，骨小梁间距减小，差异有统计学意义(P<0.05)。附子大剂量组与阳性对照组各项指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表1 6组大鼠血清Ca、P、BMD、BGP、ALP及子宫质量指数比较

与假手术组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01，*3P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

表2 6组大鼠尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平比较

与假手术组比较，*1P<0.01，*2P<0.05；与模型对照组比较，*3P<0.01，*4P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05，*2P<0.05；Compared with model control group，*3P<0.01，*4P<0.05

表3 6组大鼠骨小梁厚度和骨小梁间距比较

与假手术组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with sham operation group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

3 讨论

由于附子对心血管系统的不良反应，对附子注射液剂量参考文献[7]确定的静脉注射半数致死量(LD50)和参考文献[8]单体药物人体试验与动物实验给药剂量间等效剂量情况进行折算而确定，将附子注射液剂量定在安全范围内，对雌二醇计量参考文献[8]而确定。

骨吸收如果强于骨形成，则会引起骨量减少，甚至出现骨质疏松症，骨吸收过程与破骨细胞联系紧密，而骨形成过程与成骨细胞的功能状态较密切，若破骨细胞功能过强，骨吸收增强，可引起骨中Ca、P的流失，表现为BMD的减小、血清Ca、P水平的升高[9]。反映骨吸收代谢过程中，尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平是较常用的检测指标[10]。而对于骨形成过程与成骨细胞功能状态，以BGP和ALP为最常用的指标，能直接反映骨形成的代谢强度[11]。BGP是成骨细胞成熟的特异标志物，随着骨矿物质增加和成骨细胞的分化而分泌增加，上调BGP的药物对骨质疏松有抑制作用[12]。ALP是成骨细胞的一种胞外酶，为多糖蛋白，主要为骨的钙化提供磷酸，有利于骨的形成，ALP水平为临床治疗骨质疏松症提供可靠的指标。

在本实验中，与假手术组比较，模型对照组尿Ca/Cr、P/Cr、DPD/Cr水平升高，血清Ca、P水平均显著升高，而BMD、BGP、ALP及子宫质量指数均显著降低，同时，骨小梁厚度显著减少，骨小梁间距显著增大，说明模型对照组出现骨代谢异常表现[13]。采用附子注射液干预后，上述指标的异常表现得到了不同程度的纠正或恢复。本实验设立的3个剂量附子注射液组对上述指标影响没有显示出明显的量效关系。小剂量组和中剂量组虽能使上述指标得到一定恢复和改善，但与模型对照组比较差异无统计学意义。而以大剂量组的改变比较明显，使上述指标接近或趋向假手术组水平，与模型对照组比较均差异有统计学意义。说明与一些具有温肾助阳、填精益髓中药复方[14]比较，单味药可能需要更大的剂量才能起效，这与单味药可能仅作用于机体某些环节而中药复方对机体具有全身性调节、作用于多环节和多通路有关，这些差别也提示如果能将不同功效的单味中药进行合理组方用药，就有可能为预防和治疗骨质疏松症发掘出新的药物。

附子注射液大剂量组与阳性对照组均能改善骨质疏松症骨代谢异常表现，但两者的作用还是稍有不同，与模型对照组比较，阳性对照组子宫质量指数显著升高，差异有统计学意义。而附子注射液3个剂量组子宫质量指数轻微升高，与模型对照组比较，差异没有统计学意义，说明附子注射液和雌二醇对子宫均有刺激作用，但附子注射液作用较雌二醇温和，提示临床用雌激素替代疗法治疗骨质疏松症，有可能引起子宫组织增生而致瘤的风险。如能找到对子宫刺激作用较弱而又有效治疗骨质疏松症的药物，就有可能使女性绝经后骨质疏松症的治疗变得更安全、有效。

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Effects ofFuziInjection on Bone Metabolism and Bone Mineral Density in Ovariectomized Rats with Osteoporosis

PEI Yasong1，2，TANG Hanqing1，ZHENG Haofen2，SU Yonghua2，LI Xiaohua1

(1.SchoolofBasicMedicine,YoujiangMedicalUniversityforNationalities，Baise533000，China；2.DepartmentofOrthopaedics,ChineseMedicalHospitalofQinzhouCity，GuangxiZhuangAutonmousRegion,Qinzhou535000，China)

Objective To observe effects offuziinjection on bone metabolism and bone mineral density (BMD) in ovariectomized rats with osteoporosis. Methods A total of 60 clean grade female Wistar rats were randomly divided into sham operation group，model control group，fuziinjection low-dose，middle-dose，high-dose group and positive control group with 10 rats in each group.Osteoporosis rat model was established in model control group，fuziinjecton groups and positive control group.Fuzi

fuziinjection (5，10 and 20 g·kg-1) and positive control group received positive control (0.05 g·kg-1) by intravenous injection once daily for 8 weeks.Sham operation group and model control group were intravenously injected with the same volume of normal saline once a day for 8 weeks.Levels of serum calcium and phosphorus，BMD，uterus index，Bone gla protein (BGP)，alkaline phosphatase (ALP)，creatinine (Cr)，deoxypyridinoline (DPD)，rabecular thickness and trabecular space were examined. Results Compared with the sham operation group，levels of serum calcium，phosphorus，urine levels of Ca/Cr，P/Cr，DPD/Cr and trabecular space in model control group significantly increased (P<0.05 orP<0.01)，while BMD，uterus index，BGP，ALP and trabecular thickness decreased significantly (P<0.01).Compared with the model control group，levels of serum calcium，phosphorus，urine levels of Ca/Cr，P/Cr，DPD/Cr and trabecular space in bothfuzigroup and positive control group decreased (P<0.05 orP<0.01)，while BMD，BGP，ALP and trabecular thickness increased significantly (P<0.01).Uterus index in positive control group increased significantly compared to the model control group (P<0.01). Conclusion Bothfuziand positive control injections can improve some biochemical indices of bone metabolism in osteoporosis.The uteral stimulation effect by high dosefuziinjection is lower than positive control and the mechanism needs further investigation.

Fuziinjection；Osteoporosis；Ovariectomy；Metabolism,bone

2013-09-20

2013-11-15

*广西高等学校优秀人才资助计划(桂教人[2011]40号)

裴雅松(1976-)，男，广西钦州人，主治医师，研究方向：中西医结合骨科临床，电话：0777-2878569，E-mail：303682099@qq.com。

唐汉庆(1976-)，男，广西合浦人，副教授，硕士生导师，博士，研究方向：民族医药研究及疾病的中西医结合基础研究。电话：0776-2849479，E-mail：phdtanghanqing@163.com。

R285；R965

A

1004-0781(2015)02-0185-05

DOI 10.3870/yydb.2015.02.011