虎杖白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株增殖和生长周期的影响*

顾生玖，李美波，许有瑞，朱开梅

(桂林医学院药学院，桂林 541004)

虎杖白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株增殖和生长周期的影响*

顾生玖，李美波，许有瑞，朱开梅

(桂林医学院药学院，桂林 541004)

目的 探讨虎杖中白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株增殖和生长周期的影响。方法 采用微波辅助法提取虎杖中白藜芦醇，将12.5，25.0，50.0，100.0 μmol·L-1白藜芦醇作用人肝癌HepG-2细胞，采用噻唑蓝(MTT)法检测虎杖中白藜芦醇对肝癌细胞HepG-2细胞抑制增殖作用，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，流式细胞术(FCM)检测细胞周期的分布。结果 虎杖中白藜芦醇能显著抑制HepG-2细胞的生长，并呈现时间-浓度依赖性。流式细胞仪结果显示，白藜芦醇作用于细胞HepG-2且细胞被阻滞于S期，呈现出剂量依赖性。不同药物浓度白藜芦醇(12.5，25.0，50.0，100.0 μmol·L-1)作用人肝癌HepG-2细胞株48 h后，随着药物浓度的增大，G0/G1期的比例逐渐减小，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而实验组细胞S期的比例随着浓度增大而增加，分别达到(44.82±1.21)%，(54.00±1.71)%，(65.21±3.66)%，(77.50±4.21)%，与对照组(34.75±3.92)%比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 虎杖中白藜芦醇能明显抑制肝癌HepG-2细胞的增殖，并诱导其细胞凋亡，可引起肝癌HepG-2细胞的S期阻滞。

虎杖；白藜芦醇；HepG-2细胞；细胞周期

虎杖是临床常用中药材，为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖PolygonumCuspidatumSieb.et Zucc 的干燥根茎和根。我国大部分地区均产，主产于江苏、江西、山东、四川等地。别名阴阳莲、苦杖、酸杖、斑杖、土大黄、大叶蛇总管等，入药始见于《雷公炮炙论》[1]。虎杖中主要含蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类、鞣质等多酚性化合物[2-3]，以白藜芦醇含量最高。白藜芦醇(resveratrol)是一种天然的蒽醌萜类化合物。最近研究表明，白藜芦醇具有较强的抗肿瘤、抗炎、调节免疫功能及保护心血管等作用[4-5]，并在癌前病变肿瘤的起始及演变阶段均有抑制作用，具有良好的癌症预防及治疗前景[6]，是一种极具开发价值的天然物质，被喻为继紫杉醇之后的又一新的绿色抗癌物质。肝癌是一种常见的恶性肿瘤，严重危害人们的健康和生命。笔者拟在前期实验的基础上，选择虎杖白藜芦醇和肝癌HepG-2细胞为研究对象，通过体外实验观察虎杖白藜芦醇对肝癌细胞增殖和周期的影响，初步探讨虎杖白藜芦醇用于肝癌治疗的可能性。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 虎杖，于2011年11月采集于桂林医学院药用植物园，由药学院天然药化教研室付鹏博士鉴定为蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)的根茎及根，将样品阴干，粉碎过内径(150.0±6.6) μm(100目)筛，备用；白藜芦醇标准品(上海哈灵生物科技有限公司，含量：99.9%，批号：111535-200502)；虎杖中白藜芦醇由本实验室提取，溶解于二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)备用；噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT，美国Amresco公司，批号：0782)；DMSO(美国Amresco公司，批号：3557A37)；1640培养基(RPMI-1640，美国Gibco公司，批号：1403233)；胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司，批号：100421)；碘化丙啶(propidium iodide，PI，美国Amresco公司，批号：0975)；实验中其余试剂均为分析纯。

1.2 细胞株及培养 人肝癌细胞株HepG-2由桂林医学院科学实验中心惠赠。人肝癌HepG-2细胞用含10%FBS、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素的RPMI1640培养液，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培养箱中培养。待细胞融合状态达80%～90%时用胰酶消化后传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 仪器 旋转蒸发仪(德国，Laborota 4000 efficient)；210型高效色谱仪(美国VARIAN公司)；NJL07-3型微波炉(南京杰全微波设备有限公司)；DG3002型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)；FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司)；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；XF-20旋风医药粉碎机(黄骤市振兴机电仪器厂)；Axiover-40倒置相差显微镜(德国蔡司公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)。

1.4 虎杖白藜芦醇的提取 准确称取干燥的虎杖粉末10 g，加入20倍70%乙醇溶液浸泡4 h，在微波功率100 W，25 ℃条件下萃取10 min后，稍冷，过滤。收集滤液，经旋转蒸发仪蒸发乙醇至浓缩液无醇味。将乙醇浓缩液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，在40 ℃下减压蒸馏至干，最后得到白藜芦醇(纯度：94.62%)。

1.5 色谱条件 色谱柱为Eclipse XDB-C8柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(35：65)，流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃，检测波长303 nm，进样量10 μL。

1.6 溶液的制备

1.6.1 对照品溶液的制备 精密称取白藜芦醇标准品5 mg，用甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得到100 mg·L-1的白藜芦醇标准储备液。

1.6.2 供试品溶液的制备 精密称取白藜芦醇提取物5 mg，用甲醇溶解并定容到10 mL量瓶，经内径0.45 μm微孔膜滤过。

1.7 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加入10 mL量瓶，加甲醇至10 mL量瓶，定容，得到2，4，6，8，10 mg·L-1的白藜芦醇标准储备液。按“1.5”项下色谱条件进行检测，以峰面积(Y)为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=57.45X-0.000 01(r=0.999 3)。白藜芦醇标准品在浓度0.001～0.012 g·L-1范围内，线性关系良好。

1.8 加样回收率考察 准确称取同一批虎杖样品5份，每份各10 g，分别精密加入一定量对照品溶液，按照“1.6”的方法得到待测液，按“1.5”项下色谱条件进样测定，白藜芦醇平均回收率为98.99%，RSD=0.99%。

1.9 MTT法测定虎杖中白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株增殖的抑制率 取对数生长期的细胞，将人肝癌HepG-2细胞株浓度调整为2×104个·mL-1，按每孔100 μL接种于96孔板，每组设复孔5个。置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，吸除培养液，分别加入不同浓度白藜芦醇使其终浓度为12.5，25.0，50.0及100.0 μmol·L-1，并同时设阴性对照组(不加药)，分别培养24，48和72 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL终止培养，于37℃孵育4 h，吸取上清液，每孔再加入DMSO150 μL，轻微振荡，用酶联免疫检测仪测定波长490 nm处吸光度(A)值，并计算细胞抑制率。重复测量3次，取其平均值。抑制率(%)=(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100%。

1.10 倒置相差显微镜下观察白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株形态的影响 收集对数生长期肝癌HepG-2细胞，以每孔2×105个细胞的密度接种于6孔培养板，待细胞完全贴壁后，吸除培养液，分别加入不同浓度的白藜芦醇，使其终浓度为12.5，25.0，50.0及100.0 μmol·L-1，并同时设阴性对照组(不加药)。继续培养48 h后去掉培养液，倒置相差显微镜下观察细胞形态并摄像。

1.11 流式细胞术(flow cytometry，FCM)PI单标法检测细胞周期 按“1.2”项下方法培养细胞48 h后，1 000 r·min-1离心10 min，离心半径17.2 cm，弃上清液，再加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered salution，PBS)5 mL，再次离心，弃上清液，用预冷的PBS 1 mL重悬细胞，加入70%冰乙醇(-20 ℃)固定24 h。检测前2 000 r·min-1，离心半径17.2 cm，离心5 min去乙醇。用PBS洗涤2次，加入含有终浓度为50.0 μg·mL-1PI和100.0 μg·mL-1RNase A，4 ℃避光染色1 h，用流式细胞仪进行检测。

2 结果

2.1 对人肝癌HepG-2细胞株增殖的影响 虎杖中白藜芦醇对肝癌HepG-2细胞增殖的影响结果见图1。虎杖中白藜芦醇对肝癌HepG-2细胞的增殖有抑制作用，且随着药物浓度的升高或时间延长，抑制率逐渐增加。当白藜芦醇浓度达到50.0，100.0 μmol·L-1时，其对HepG-2细胞增殖抑制作用明显增强，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。100.0 μmol·L-1白藜芦醇作用于HepG-2细胞48和72 h，对细胞抑制率分别达48.73%，58.75%。

2.2 HepG-2细胞形态学变化 经不同浓度白藜芦醇孵育HepG-2细胞24 h后，倒置相差显微镜下观察形态变化，结果见图2。结果显示：未添加白藜芦醇的阴性对照组，HepG-2细胞贴壁生长良好，细胞排列紧密、边界清楚，细胞饱满呈现多边形或梭形，细胞密度大。白藜芦醇12.5 μmol·L-1组细胞形态学变化与对照组相比，变化不明显。其余组细胞贴壁数量均有不同程度的减少，细胞排列紊乱，50.0和100.0 μmol·L-1组细胞生长状态明显较阴性对照组差，细胞皱缩，贴壁不佳，细胞间隙变大，脱落明显增多，胞液中有漂浮的细胞。

图1 白藜芦醇对肝癌HepG-2细胞增殖的影响

Fig.1 Effect of Resveratrol on the growth of HepG-2 cells

2.3 虎杖中白藜芦醇对HepG-2细胞的细胞周期影响及结果分析 HepG-2细胞经不同浓度白藜芦醇作用48 h后，FCM检测细胞周期分布，结果见图3和表1。根据统计结果显示：随着药物作用浓度增大，G0/G1期细胞的比例逐渐减小，与对照组比较差异有统计意义(P<0.05)；实验组细胞S期的比例随着浓度增大而增加，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中50.0 μmol·L-1，100.0 μmol·L-1组与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。各浓度组间比较，随着药物浓度增高，S期细胞比例逐渐增加，表现出一定的浓度依赖性。不同浓度细胞G2/M期比例有差异，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。对细胞周期结果分析显示，白藜芦醇可影响HepG-2细胞周期的分布，将HepG-2细胞阻滞在S期。

A.阴性对照组；B.25.0 μmol·L-1白藜芦醇组；C.50.0 μmol·L-1白藜芦醇组；D.100.0 μmol·L-1白藜芦醇组

A.阴性对照组；B.12.5 μmol·L-1白藜芦醇组；C.25.0 μmol·L-1白藜芦醇组；D.50.0 μmol·L-1白藜芦醇组；E.100.0 μmol·L-1白藜芦醇组

图3 不同浓度白藜芦醇作用肝癌HepG-2细胞48 h后细胞周期分布

A.negative control group;B.12.5 μmol·L-1resveratrol group；C.25.0 μmol·L-1resveratrol group；D.50.0 μmol·L-1resveratrol group; 100.0 μmol·L-1resveratrol group

Fig.3 Cell cycle distribution of HepG-2 cells after 48 h treatment by different concentration of resveratrol

表1 5组HepG-2细胞经作用48 h后不同周期细胞所占比例测定结果

与阴性对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

3 讨论

原发性肝癌是常见恶性肿瘤之一，我国是肝癌高发区，发病率占世界肝癌总数的43.7%，南方地区发病率更高[7]。原发性肝癌具有早期诊断困难，发现时多为中晚期，已失去手术机会，常规放、化疗药物作用局限，预后差等特点。中药可以弥补手术治疗、放射治疗、化学治疗的不足，既能巩固放疗化疗的效果，又能消除放、化疗的毒副作用，更重要的是可以切断癌细胞的复制功能[8]。因此，寻找毒副作用小，效果明显的抗癌药物就成为了研究重点。最近研究显示，白藜芦醇能抑制多种体外培养的肿瘤细胞系的增殖如宫颈癌、肾细胞癌[9-10]等。本实验结果显示虎杖中白藜芦醇能抑制肝癌HepG-2细胞株的增殖，且对肝癌细胞的抑制作用有时间和剂量依赖性，随着作用时间延长和作用浓度增加，抑制作用明显增强，提示可直接作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞生长。当药物浓度达到100.0 μmol·L-1时，作用72 h后对肝癌HepG-2细胞株的抑制率可达到58.75%，显示出较强的抗肿瘤活性。有学者进行DNA微阵列分析乳腺癌细胞株MCF-7，研究白藜芦醇的抗肿瘤可能机制，但具体作用机制仍需深入探讨[11]。

有研究报道，白藜芦醇抑制肿瘤细胞的增殖主要表现在抑制肿瘤细胞DNA的合成[12-13]，或针对细胞周期G1→S和S→G2期，通过对细胞周期素的影响，上调或减少细胞周期依赖激酶等，从而使细胞周期发生阻滞。笔者在本研究中也发现虎杖中白藜芦醇作用于肝癌HepG-2细胞48 h后，可抑制癌细胞从S期进入G2/M期，使G0/G1比例显著减少，S期比例显著增多，将细胞阻滞于S期，通过抑制DNA的合成，从而抑制癌细胞的生长，并存在剂量依赖关系。

[1] 樊慧婷，丁世兰，林洪生.中药虎杖的药理研究进展[J].中国中药杂志，2013，38(15)：2545-2548.

[2] 李菁雯，陈祥龙，孟祥智.虎杖及其提取物的研究进展[J].中医药学报，2011，39(3)：103.

[3] 刘芝兰，曾春娇，关梅春，等.白藜芦醇与白皮杉醇及赤松素研究进展[J].医药导报，2013，32(8)：1043-1049.

[4] ROCCARO A M，LELEU X，SACCO A，et al.Resveratrol exerts antiproliferative activity and induces apoptosis in Waldenström's macroglobulinemia[J].Clin Cancer Res，2008，14(6)：1849-1858.

[5] 梁力，李晰，王庆伟，等.小鼠血浆中白藜芦醇含量测定及药动学研究[J].医药导报，2012，31(7)：846-847.

[6] 刘小丽，张伟，符毅文.虎杖中白藜芦醇的超声提取及其氧化性研究[J].中成药，2011，33(1)：150-153.

[7] KOPPELMANS V， DE GROOT M D，DE RUITER M B，et al.Global and focal white matter integrity in breast cancer survivors 20 years after adjuvant chemotherapy[J].Hum Brain Mapp，2014，35(3)：889-899.

[8] 陈丹丹，刘媛，姬旭慧.原发性肝癌发病影响因素的病例对照研究[J].郑州大学学报(医学版)，2013，48(2)：249-253.

[9] 周学武，陈建荣，刘桂艳，等.白藜芦醇对人宫颈癌Hela细胞凋亡、增殖影响的实验研究[J].齐齐哈尔医学院学报，2008，29(20)：2457-2459.

[10] 单中杰，魏金星，韩前河，等.白藜芦醇对人肾细胞癌786-0细胞PDCD5表达的影响[J].中国实验诊断学，2012，16(5)：785-788.

[11] LEON-GALICIA I，DIAZ-CHAVEZ J，GARCIA-VILLA E，Resveratrol induces downregulation of DNA repair genes in MCF-7 human breast cancer cells.[J].Eur J Cancer Prev，2013，22(1)：11-20.

[12] PRABHU V，SRIVASTAVA P，YADAV N，et al.Resve-ratrol depletes mitochondrial DNA and inhibition of autophagy enhances resveratrol-induced caspase activation[J].Mitochondrion，2013，13(5)： 493-499.

[13] LOU X D，WANG H D，XIA S J，et al.Effects of resveratrol on the expression and DNA methylation of cytokine genes in diabetic rat aortas[J].Arch Immunol Ther Exp (Warsz)，2014，62(4):329-340.

Effects of Resveratrol fromPolygonumCuspidatumon Proliferation and Cell Cycle of HepG-2 Cells

GU Shengjiu, LI Meibo, XU Yourui, ZHU Kaimei

(CollegeofPharmacy,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To investigate effects of resveratrol on the growth and cell cycle of human hepatoblastoma-derived HepG-2 cell line. Methods Resveratrol was extracted by microwave-assisted method and HepG-2 cells were exposed to resveratrol at different concentrations (12.5, 25.0, 50.0, 100.0 μmol·L-1).The viability of HepG-2 cells was measured by MTT.Morphologic changes of the cells were observed under the phase contrast microcope.The cell cycle of HepG-2 cells treated with resveratrol was analyzed by flow cytometry. Results Resveratrol could significantly inhibit proliferation of HepG-2 cells and increase the cells in the S phase in a dose-dependent manner.After 48 h treatment with different concentrations of resveratrol (12.5, 25.0, 50.0 and 100.0 μmol·L-1), the cell proportion of G0/G1phase decreased as compared with control group (P<0.05).The cell proportion of S phase increased in a dose-dependent manner, ranging from (44.82±1.21)%, (54.00±1.71)%, (65.21±3.66)% and (77.50±4.21)%, respectively, in the treatment groups as compared with negative control group[(34.75±3.92)%] (P<0.05). Conclusion Resveratrol can inhibit the proliferation of HepG-2 cells in vitro by inducing cell blockage at S phase.

PolygonumCuspidatum; Resveratrol; HepG-2 cell line; Cell cycle

2014-01-17

2014-07-07

*广西科技攻关项目(桂科合14123001-22，桂科能129825-21)；广西教育厅科技项目(201202ZD065，2013YB154，2013lX080)；桂林市科技攻关项目(20140122-5，20140105-5，20140105-6，20130103-8，20130103-9，20130113-1，2013lX080)。

顾生玖(1965-)，男，甘肃靖远人，教授，博士，主要从事心血管病理及药物防治研究。电话：(0)13607733816，E-mail：gushengjiu@163.com。

朱开梅(1967-)，女，广西桂林人，教授，硕士，主要从事化学致病分子机制和药物防治研究。电话：(0)18978345717，E-mail：glzkm@163.com。

R965

A

1004-0781(2015)02-0162-05