黄羽肉鸡中一株ALV-J的分离与鉴定

李瑞典 李中信（河北省任丘市畜牧水产局 062550）

J亚群禽白血病毒(ALV-J)是20世纪80年代末Payne等人首先从肉用型鸡中分离鉴定出来的ALV新亚群[1]，在过去的几十年中，ALV-J已经在世界各地被报道[2,3,4,5]。我国于1999年首次从白羽肉鸡中发现ALV-J[杜岩]，随后在蛋鸡中被报道[6]，由于世界范围内的白血病净化进程的成功，在中国的白羽肉鸡和蛋鸡中出现ALV-J的可能性大大减小。然而，最近ALV-J的感染在中国地方品系鸡群中不断被报道[7,8,9]。

本文报道了一例ALV-J在山东黄羽肉鸡中的感染的病例。我们发现这株毒株与之前在白羽肉鸡和美国分离株亲缘关系非常近。因此，一些有效的预防和净化措施需要尽快制定。

1 材料和方法

1.1 细胞 鸡胚成纤维细胞(CEF)，按照常规方法制备。SPF鸡胚购自济南SPAFAS。

1.2 病鸡来源 2014年3月，山东某黄羽肉鸡养殖场肿瘤发病率升高，对死亡鸡剖检发现肝脏和脾脏肿大并布满白色肿瘤结节。

1.3 抗体检测 采集送检鸡只血清，参照试剂盒说明书分别用IDEXX公司ALV-J、ALV-A/B和REV的抗体检测试剂盒进行抗体检测。对于ALV-J抗体：如果S/P值小于等于0.6，样品为阴性；如果S/P值大于0.6，样品为阳性；对于ALV-A/B抗体：如果S/P值小于等于0.4，样品为阴性；如果S/P值大于0.4，样品为阳性；对于REV抗体：如果S/P值小于等于0.5，样品为阴性；如果S/P值大于0.5，样品为阳性。

1.4 病毒分离与鉴定 无菌采集送检鸡只抗凝血，取血浆接种于已长成单层长至70%～80%的CEF细胞。接种血浆后37℃孵育2～3h后弃掉上清液，无菌PBS缓冲液漂洗2次，换为1%细胞维持液。传3代后，分别取100ul细胞培养上清用AvianLeukosisVirusAntigenTestKit检测ALV群特异性抗原p27。对于细胞，固定液(丙酮:乙醇=3:2)固定后分别使用针对MDV、REV、ALV-J和ALV-A/B的单抗或单因子血清进行IFA鉴定，荧光显微镜下观察。

1.5 引物设计与合成 根据GenBank中公布的ALV基因组序列，用Premier5.0设计相应引物（表1），扩增包含整个env基因。引物由华大基因科技服务有限公司合成。

表1 引物序列

1.6 目的片段的扩增 将病毒分离为阳性的血浆样品用RNA提取试剂盒(按照OMEGA公司的RNA提取试剂盒说明书进行)提取病毒粒子基因组RNA，应用宝生物两步法反转录试剂盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0(Takara Bio,Shiga,Japan)，将提取的RNA进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。PCR产物经1%琼脂糖电泳，切下目的条带并用胶回收试剂盒回收。将回收的DNA连接PMD18-T载体，转化DH5a感受态细胞。将三个独立的阳性克隆送华大基因科技服务有限公司测序。应用软件DNAstar Lasergen7.1将分离株 env基因编码的gp85和gp37氨基酸序列分别与不同亚群毒株的相应序列进行同源性比较，以确定分离病毒的亚群分类。同源性比较使用ClustalW Method。

2 结果

2.1 抗体检测结果 对血清检测抗体表明，REV抗体呈阴性；ALV-A/B抗体为阴性；ALV-J抗体为阳性(表2)。

表2 病鸡的抗体结果

图1 接种病鸡血浆的CEF细胞针对ALV-J的IFA检测结果 (200倍)

2.2 病毒分离和鉴定结果 病毒分离结果表明，1份样品的细胞培养上清p27为阳性；该样品针对ALV-J的IFA均为阳性(图1)，说明分离到一株ALV-J。取该样品的血浆进行RT-PCR测序，将该分离株命名为SD14HY01。所有样品针对MDV、REV和ALV-A/B的IFA均为阴性，说明不存在MDV、REV和ALV-A/B的混合感染情况。

2.3 进化树分析 将SD14HY01的env基因与8株国际参考株和另外16株从中国白羽肉鸡中分离到的参考株比较。结果显示，SD14HY01与参考株在gp85氨基酸序列上高度同源，gp85氨基酸同源性介于84.6.1%～96.4%之间。根据gp85的系统进化树可以看出(图2)，SD14HY01与2013年从某地方肉用型鸡以及2006年从中国黄羽肉鸡中分离到毒株亲缘关系较近。并且和中国白羽肉鸡HN0001株以及美国株6803在同一个分支上。

3 讨论

（1）尽管距离ALV-J第一次在英国发现仅仅过去了20多年[1]，该病毒在它的致病性和抗原性上出现了迅速演变。作为世界第二大肉鸡生产商，中国在1999年之前没有ALV-J感染的报道[10]。在21世纪，国际种鸡场对ALV-J已经实施了不同程度的进化。在中国的白羽肉鸡和蛋鸡中出现ALV-J可能性大大减小。然而，最近ALV-J在中国地方品系鸡中的感染变得越来越严重。有许多关于ALV-J在中国地方品系鸡包括黄鸡中感染的报道[7,9]。尽管之前有零散的出现，本文报道了一例山东地区黄羽肉鸡中有ALV-J的感染病例。（2）中国地方品系鸡品种的多样性和它们生长性能的不同给ALV-J的出现和变异提供了一个得天独厚的环境。同时，不同品系鸡的混合饲养以及使用相同的孵化器加速了ALV-J的水平传播[11]。这些条件导致了ALV-J的多样性，使得ALV-J的感染变得更加复杂和多样化。（3）进化树分析显示本文分离的这个毒株与从美国白羽肉鸡中的分离株6803以及在2000年从河南的中国父母代的白羽肉鸡中分离代的HN0001有密切联系(图2)。进化树分析还表明本文的这株毒株可能与从广州黄鸡中分离到的毒株拥有一个共同的祖先。美国株4817与8株中国分离株很可能拥有一个共同的祖先[12]。先前的研究发现从中国地方品系鸡黄鸡中分离的GD0512株与2000年在一个父母代白羽肉鸡中分离的HN0001株同源性最近。另外5株从黄鸡中分离到的病毒与HN0001株和从白羽肉鸡中分离到的美国株0661关系也很近[9]。因此，我们推测中国地方品系鸡中ALV-J的感染可能是由于90年代一些地方品系鸡公司与白羽肉鸡的杂交育种实践。在接下来的培育过程中，并没有对感染有ALV-J的鸡净化，从而导致更加严重的感染。更严重的是，黄鸡与纯地方品系鸡共同饲养在同一个鸡场，甚至共用孵化器，这可能导致了该纯地方品系鸡的感染。

本研究鉴定了一例山东地区黄羽肉鸡中ALV-J的感染，同时对该毒株的进化做了一定的分析，发现很可能是由于杂交育种而感染。所有的这些证据表明中国地方品系鸡感染ALV-J需要得到更进一步的重视。

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