小熊猫卵巢肥大细胞与雌性生殖干细胞的初步观察

修云芳，王全溪，邵良平，李碧春，徐素慧，陈玉村

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2.海峡（福州）大熊猫研究交流中心，福建福州350001；3福建农林大学动物科学学院，福建福州350002）

肥大细胞（mast cells，MCs）来源于骨髓造血干细胞，通常分布于皮肤下层、呼吸道、消化道黏膜以及黏膜下的血管、淋巴管周围的结缔组织中［1］。据报道，卵巢MCs的数量与分布因发情周期不同而呈规律性改变，研究表明这些细胞参与卵巢功能的局部调节［2］。在生理条件下，MCs内有相当量的组胺。据报道，发情前期大鼠与仓鼠卵巢肥大细胞及脱颗粒数量增加导致卵巢组胺含量增加。有研究表明热应激导致肥大细胞数量与组胺含量同时增加［3］。MCs衍生物—组胺参与刺激排卵、卵巢的血液循环及毛细血管通透性改变。

雄性哺乳动物，由于精原干细胞（germline stem cells，GSCs）的存在，精子发生可以贯穿整个生命周期。自从20世纪50年代始，以美国科学家Zuckerman提出的哺乳动物卵巢“固定卵泡库”理论占主导地位，认为哺乳动物雌性配子的发生仅出现于胚胎发育期，出生后卵巢中生殖细胞已发育到了原始卵泡阶段，并停止于第一次减数分裂的双线期，之后这些卵泡凋亡或者待休眠一段时间后重新启动发育，雌性哺乳动物出生后没有卵子再生［4］。然而，最近研究发现成年哺乳动物的卵巢内存在雌性生殖干细胞（female germline stem cells，FGSCs）且能生成新的卵母细胞［5－6］。

小鼠脉管同系物（mouse vasa homolog，MVH）是果蝇vasa基因的同源类似物，其编码产物是一个DEAD 家族的RNA 解旋酶。MVH 首先从小鼠的PGC中克隆出来，随后在各阶段的生殖细胞中均检测到了其表达，MVH 基因缺陷型小鼠的生殖细胞出现分化停滞和凋亡现象，同时Oct4基因的表达水平也随之降低，小鼠失去生殖能力。因此MVH 作为一个在生殖细胞发育中起重要作用的基因，被公认为是生殖细胞的特异标志基因。小熊猫卵巢组织学结构已有报道［7］，但无小熊猫卵巢FGSCs、MCs及组胺分布的报道。本研究收集15例不同时期小熊猫卵巢，观察其中FGSCs及肥大细胞分布与数量，为了解MCs在小熊猫生殖过程中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 15只来自福州某地的因非生殖系统疾病死亡的小熊猫。按照动物所处不同生理周期将卵巢样本分组：发情期4个，乏情期7个，妊娠期4个。

1.1.2 主要试剂 甲苯胺蓝、阿尔新蓝Alcian blue 8GX、番红花红Safranine O 为上海化学试剂厂产品；鼠抗组胺抗体为美国Sigma 公司产品；鼠抗MVH 抗体、兔抗小鼠IgG1为北京博奥森生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品收集与处理 将卵巢切成约1.5cm×1.5cm×0.5cm 大小组织块，浸泡在40mL／L福尔马林中，4℃保存4h。按常规组织学技术制备石蜡切片，以5μm 厚度半连续切片。

1.2.2 肥大细胞染色 组织块贮存在Carnoy’s固定液，甲苯胺蓝染色呈现MC 颗粒异染特征。石蜡切片脱蜡至水，用甲苯胺蓝浸泡30s，然后用双蒸水洗3min两次，950mL／L 乙醇分色，在显微镜下观察直至MCs呈现紫红色颗粒出现便停止分色，在乙醇中快速脱水后置二甲苯中透明，中性树胶封片。

AB－S染色：切片脱蜡复水，然后在3.6g／L Alcian blue 8GX 和0.18g／L Safranine O 的醋酸钠－盐酸缓冲液（pH 1.42）中染色30 min，在乙醇中快速脱水后置二甲苯中透明，中性树胶封片。

1.2.3 组胺阳性（histamine－positive）细胞及小鼠脉管同系物（MVH）－阳性细胞免疫组化染色 切片常规脱蜡至水，30 mL／L 的H2O2室温5 min～10 min以灭活内源性过氧化物酶，50 mL／L 即用型正常山羊血清培养0.5h，然后在含0.2mL／L的TritonX－100、0.1mL／L的Bsat和鼠抗组胺抗体（稀释度为1∶400）（或者小鼠抗MVH 抗体）磷酸buffer液（pH7.0）4℃过夜孵育，PBS 漂洗后，兔抗小鼠IgG1室温孵育1h，抗生物素蛋白－生物素－过氧化物酶结合物中室温孵育1h。用PBS冲洗切片3 次，DAB显色，PBS冲洗，苏木素复染，脱水，透明，盖玻片封片。

1.2.4 统计分析 卵巢样本按取材动物的生理周期，分为发情期，乏情期与妊娠期3组。每个样本选5张切片，使用LEICAR 2800 显微镜40×10 倍观察，每张切片观察5个视野。统计每个视野MCs平均数。采用SPASS11.0 软件单因素方差分析和Fisher最小显著差异检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 不同时期小熊猫卵巢中MCs分布情况

小熊猫卵巢中单位视野下MCs数量，妊娠期平均4.18±0.34个，乏情期平均8.39±0.39，发情期11.08±0.70。不同时期MCs数量差异极显著（P＜0.01）。数量与分布随着发情周期呈规律性变化，发情期最高，乏情期次之，妊娠期数量最少（图1）。

2.2 小熊猫卵巢MCs的形态与类型

小熊猫卵巢MCs呈圆形，椭圆形或者不规则形（图2A）。苯甲胺蓝染色呈异染性，胞质中充满紫色粗糙颗粒，细胞核小，呈圆形或椭圆形，位于细胞中间或偏于一侧。MCs分布在血管壁或者卵泡周围的结缔组织中。发情期与乏情期它们大多分布在皮质区与卵泡周围（图2A、2C），发情期MCs较乏情期（图2B）与妊娠期大。AB－S染色异染颗粒呈蓝色的为黏膜型（图2D）；异染颗粒呈红色的结缔组织型（图2E）；异染颗粒呈红蓝间染色的为混合型（图2F）。

图1 小熊猫不同周期卵巢肥大细胞数量Fig.1 Number of ovary mast cells in the different cycle of red panda

2.3 小熊猫卵巢组胺阳性细胞形态与分布

检测到小熊猫卵巢有组胺阳性细胞存在，其分布规律呈周期性变化，阳性细胞形态大，呈圆形或椭圆形，细胞核呈圆形位于细胞中间，细胞质内有大量组胺阳性颗粒（图2G）。乏情期的卵巢组胺阳性细胞数量较少，形态小，呈圆形（图2H）。发情期的卵巢组胺阳细胞数量多。妊娠期卵巢组胺阳性细胞较大，呈椭圆形，但是细胞质内的阳性颗粒明显较少（图2I）。

2.4 小熊猫卵巢中MVH 的表达

小熊猫卵泡内卵母细胞呈MVH 阳性，我们在生殖上皮内也发现了MVH 阳性细胞，我们认为这些细胞可能是FGSCs（图3）。

3 讨论

图2 小熊猫卵巢肥大细胞及组胺表达Fig.2 Mast cells and expression of histamine in red panda ovaries

图3 小熊猫卵巢MVH 阳性表达Fig.3 Positive expression of MVH in the ovary of red panda

MCs是机体组胺的主要来源，MCs以旁分泌的方式参与许多内分泌腺体如卵巢、甲状腺、肾上腺和睾丸的局部调节。发情周期卵巢中MCs的数量与分布变化规律表明这些细胞参与卵巢功能的局部调节。体外试验表明，MC 脱颗粒作用和MC 诱导的白细胞介素8与卵泡发育和排卵有关［8］。大鼠卵巢髓质MCs数量在发情期最多，乏情期次之，发情前期数量最少，MCs在发情前期脱颗粒。发情前期仓鼠卵巢MCs数量最低，同时脱颗粒及组胺水平增加。牛的卵巢发情前期（Day 19）优势卵泡内的MCs数量增加与卵泡发育有关，MCs数量降低与排卵有关。闫金坤等［9］研究发现，摘除卵巢导致小鼠小肠MCs显著减少，而适量补充雌二醇可在一定程度上增加MCs的数量。小熊猫卵巢MCs数量呈规律性变化，发情期最高，乏情期次之，妊娠期最少。小熊猫乏情期血清雌二醇维持在低水平，发情期血清雌二醇处于高水平，排卵后降至基础水平［10］。本试验未能同时监测小熊猫血清中雌二醇的浓度，但本研究初步显示小熊猫卵巢MC 数量与发情周期雌二醇浓度密切相关，MCs可能对小熊猫的受精、胚胎着床和妊娠有调节作用。

研究表明，GSCs与卵原细胞分布在卵巢上皮与皮质区，在胎儿卵巢中，卵母细胞位于原始卵泡边缘。20世纪50年代早期，形成了关于哺乳动物出生卵母细胞池就形成且不能再生的理论，该理论限制了卵巢功能不全及因老年化或疾病导致不育的治疗。出生后小鼠卵巢中有生殖细胞增殖与卵泡更新，卵巢表面大的呈卵圆形的生殖细胞可能是GSCs。成年小鼠的卵巢中存在罕见的雌性生殖干细胞。与成年雄性哺乳动物睾丸精原干细胞维持精子生成类似，这些细胞能产生新的卵母细胞［11］。用抗MVH 抗体免疫组化法鉴定FGSCs，发现生殖上皮内有MVH 阳性细胞，据此我们认为成年小熊猫卵巢内有FGSCs，这项发现将为小熊猫繁殖生物技术提供理论支持。

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