既济汤对脑缺血/再灌注诱导的血管性痴呆小鼠认知功能和脑内氧化应激的影响*

刘丰熙， 牛 凯， 吴志刚， 薛贵平， 杨建明， 张丹参△

(1. 河北北方学院药学系， 张家口 075000； 2. 圣大(张家口)药业有限公司， 河北 张家口 075000)



既济汤对脑缺血/再灌注诱导的血管性痴呆小鼠认知功能和脑内氧化应激的影响*

刘丰熙1， 牛 凯2， 吴志刚1， 薛贵平1， 杨建明1， 张丹参1△

(1. 河北北方学院药学系， 张家口 075000； 2. 圣大(张家口)药业有限公司， 河北 张家口 075000)

目的：本研究旨在探讨既济汤对脑缺血/再灌注诱导的血管性痴呆(VD)小鼠认知功能和脑内氧化应激水平的影响。方法：将32只小鼠随机分为4组(n=8):正常组、假手术组(手术但不执行脑缺血/再灌注)、模型组(复制脑缺血/再灌注诱导的VD模型)、既济汤治疗组(复制脑缺血/再灌注诱导的VD模型后既济汤治疗)。术后给予既济汤20 ml/kg，每天1次，连续给药14 d，通过避暗实验、探索实验和跳台实验检测所有小鼠的行为学表现。最后取脑，检测脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，评价脑内的氧化应激水平的变化情况。结果：避暗实验结果显示，既济汤治疗组较模型组动物逃避潜伏期显著延长(P<0.01)，错误次数显著下降(P<0.01)；探索实验结果显示，既济汤治疗组较模型组显著缩短小鼠到达暗室时间(P<0.05)、到达高端时间(P<0.01)、到达后面明室时间(P<0.01)，并且显著增加爬高端的次数(P<0.01)；跳台实验表明，既济汤治疗组较模型组能够显著延长小鼠的逃避潜伏期(P<0.01)。与正常组、假手术组比较，模型组小鼠脑组织匀浆中SOD活性显著降低(P<0.01，P<0.01)、MDA含量显著升高(P<0.01，P<0.01)；与模型组比较，既济汤治疗组小鼠脑组织SOD活性和MDA含量明显回落(P<0.01，P<0.01)。结论：既济汤可显著改善VD小鼠的认知功能，其机制可能与其抑制脑内的氧化应激有关。

既济汤; 血管性痴呆; 认知功能; 氧化应激; 小鼠

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是全球范围内仅次于阿尔茨海默病的第二位痴呆性疾病[1]。随着人口老龄化的来临，我国VD的发病逐年增加，并有加速的趋势[2]。VD不但严重影响患者的生活质量，而且为家庭和社会增添了沉重经济和情感负担。目前，虽然已有大量学者专注于VD的基础和临床研究，但临床上仍没有特异性的治疗方案，主要从平衡神经递质、改善脑循环以及保护脑细胞着手，治疗效果不理想。

传统医学认为，VD属于中医的 “痴呆”、“呆症”、“健忘”等疾病范畴，病在脑，与心和肾的关系密切[3]。以往的治疗多采用补益心血、补肾益气、活血化淤、祛痰开窍等治疗方法，从单一脏腑的角度治疗VD。作者立足中医的整体观念，从脏腑间的相互联系出发，认为心肾不交可能是VD发生的重要原因。因此，本文从交通心肾入手，以小鼠为对象，线栓法建立脑缺血/再灌注损伤VD模型，通过行为学实验，观察自拟方既济汤(在具有镇静安神、交通心肾的功效的交泰丸的基础上加减而成)对VD的干预效果，并从氧化应激的角度探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

SBA-2程控避暗箱、XTY-2探索运动试验仪和STT-2跳台仪，均购自中国医学科学院药物研究所。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。既济汤组方原则是交通心肾、理气开窍。所含中药：远志、黄连、肉桂、益智仁、枸杞子、菟丝子、熟地、石菖蒲、炒枣仁、陈皮、泽泻、白芍、阿胶和黄芩，均购自张家口市华佗药房，严格按临床用药煎煮方法熬制成常规药液。1 ml药液含生药1克。

1.2 动物与分组

健康昆明种雄性小鼠32只，体重(28±2)g，随机分为4组(n=8)：分别为正常组、假手术组(进行手术，但不进行脑缺血/再灌注)、模型组(复制脑缺血/再灌注诱导的VD模型)、既济汤组(复制脑缺血/再灌注诱导的VD模型后，既济汤治疗)。

1.3 模型制备与给药方法

动物麻醉(3.5%水合氯醛10 ml/kg，腹腔注射)后，分离两侧颈总动脉，分离后用液体石蜡浸泡过的黑色手术线穿过左右两侧颈总动脉，尽量恢复两侧颈总动脉到原位，在气管上方轻轻将黑色手术线打一松的反手结，结的松紧以不压迫气管为宜。在每侧颈总动脉上方的黑线上穿过一条用液体石蜡浸泡过的白色手术线，按Himori法埋线后缝合切口[4]。术后48 h将颈下黑色手术线拉紧，阻断两侧颈总动脉造成大脑缺血状态， 5 min后轻拉两侧白色手术线，使颈总动脉恢复血液再灌注。

既济汤治疗组动物每日早7:00灌胃给既济汤，20 ml/kg，每天1次，连续给药14 d；正常组、假手术组和模型组动物每日早7:00给等量蒸馏水，每天1次，也连续给14 d。

1.4 行为学实验

1.4.1 避暗实验 避暗箱有明暗两间隔室，两室间有一个直径为3 cm圆形通道，两室底部均为不锈钢栅栏。明室栅栏始终不通电，暗室栅栏通电(40 V)。小鼠受到电击后立即逃避到明室，PcLab生物信号采集系统完成数据收集。第14天给药后1 h进行避暗实验，实验分为训练和测试，训练前将小鼠放入避暗箱内适应3 min，然后将小鼠背向洞口放入明室，由于小鼠具有嗜暗习性，易进入暗室，进入暗室后由于受到电击迅速逃离。在5 min内经多次电击，小鼠形成记忆，记录24 h后3 min内小鼠受到电击的次数(错误次数)以及首次犯错误的时间(逃避潜伏期)。

1.4.2 探索实验 探索运动实验仪，由一个暗室和两个明室组成，可记录动物的活动行为信号。第14天给药后1 h进行探索实验，首先将小鼠放在前面明室中，同时打开箱门，当小鼠钻进暗室时，则关上门断其后路。记录小鼠到达暗室时间、到达高端时间、到达明室时间(指后面的明室)和小鼠爬高端的次数。

1.4.3 跳台实验 跳台实验测试仪由5个隔室构成，可同时测试5只动物，每个隔室有一橡皮台，箱底是可通电的铜栅，训练期，小鼠跳下平台在通电后的箱底不断被电击，这个过程中获得记忆；24 h后观察小鼠第一次跳下平台的时间和3 min内跳下平台的次数。第14天给药后1 h进行实验，先将小鼠放入反应箱内适应 3 min，然后立即通36 V交流电，动物受到电击跳上平台，训练 3 min。24 h后，将小鼠轻轻置于平台上，记录从小鼠被放至平台到第一次跳下的时间，即跳台潜伏期；同时记录 3 min内小鼠跳下平台的次数，即错误次数。

1.5 小鼠脑组织SOD和MDA含量测定

行为学实验检测结束后，小鼠迅速断头处死，冰台上取脑，冷生理盐水冲洗后，用滤纸吸干表面的水分，称重，制备10%脑组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液备用。黄嘌呤氧化酶法检测脑组织中SOD活性，硫代巴比妥酸法检测MDA含量。脑组织匀浆用BCA法蛋白定量。SOD活性和MDA含量以脑组织中总蛋白校准[5]。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 行为学实验结果

避暗实验结果显示：与正常组和假手术组比较，模型组动物错误次数显著增加(P<0.01)；既济汤治疗组较模型组动物逃避潜伏期显著延长(P<0.01)，错误次数显著下降(P<0.01)；而且既济汤治疗组动物逃避潜伏期显著高于正常组和假手术组(P<0.01，P<0.01)，错误次数显著少于正常组(P<0.05，表1)。探索实验结果显示：与正常组比较，模型组动物到达暗室时间(P<0.05)、到达高端时间(P<0.01)和到达后面明室时间(P<0.01)都显著延长；与假手术组比较，模型组动物到达暗室时间(P<0.05)和到达后面明室时间(P<0.01)显著延长；与模型组比较，既济汤治疗组动物到达暗室时间(P<0.05)、到达高端时间(P<0.01)和到达后面明室时间(P<0.01)都显著缩短，爬高次数显著增加(P<0.01)；而且既济汤治疗组动物爬高次数也显著高于正常组和假手术组(P<0.01，P<0.01)；但既济汤治疗组动物到达后面明室时间仍显著高于正常组和假手术组(P<0.05，P<0.05，表2)。跳台实验结果显示：既济汤治疗组动物的逃避潜伏期较模型组、正常组和假手术组都显著增加(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；模型组动物错误次数较正常组和假手术组显著增多(P<0.05，P<0.05)，既济汤治疗组动物的错误次数较模型组有所减少，但无统计学差异(P>0.05，表3)。

GroupEscapinglatency(s)Errorcountsin3minsNormal7.75±3.6943.13±19.73Sham8.63±3.4639.00±13.47Model7.13±4.0263.38±13.28**##JiJidecoction-treated19.13±10.66**##△△25.63±8.19*△△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group

Tab. 2 Effects of Jiji decoction on data of spatial probe test in mice with vascular dementia

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group

GroupEscapinglatency(s)Errorcountsin3minsNormal8.86±3.645.25±2.19Sham9.25±3.654.88±1.89Model4.88±2.108.63±3.46*#JiJidecoction-treated15.75±6.67**##△△6.13±3.27

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group

2.2 脑组织中SOD活性和MDA含量的测定

与正常组和假手术组比较，模型组小鼠脑组织匀浆中SOD活性显著降低(P<0.01，P<0.01)、MDA含量显著升高(P<0.01，P<0.01)；与模型组比较，既济汤治疗组小鼠脑组织中SOD活性和MDA含量明显回落(P<0.01，P<0.01，表4)。

3 讨论

VD是目前唯一一种可以预防和治疗的痴呆类型。传统医学近年的理论研究提示，“心肾不交”在VD的发病中起着重要作用[6，7]。交泰丸是“交通心肾”的经典方剂[8]。因此，本研究在交泰丸的基础上加减组成既济汤，改良后的方剂消炎抗菌成分降低，镇静催眠成分显著提高，进而观察其对认知行为的影响。脑缺血/再灌注损伤是目前通用的复制大鼠、小鼠VD模型的方法[9]。本研究发现，脑缺血/再灌注损伤小鼠出现显著地认知功能障碍，表现为：小鼠在避暗实验或跳台实验中错误潜伏期缩短、错误次数增加；探索实验中小鼠到达暗室、高端和明室的时间显著延长。当给予既济汤连续14 d的治疗后，VD小鼠的认知功能障碍明显改善。实验还发现，既济汤治疗组动物在避暗实验中的逃避潜伏期、错误次数，探索实验中的爬高次数的表现都显著优于正常组。这些结果提示，既济汤对正常动物的学习记忆功能也有显著地提高作用。因此，这些实验表明既济汤以“交通心肾”为靶点能够显著改善VD的痴呆症状。

GroupSOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)Normal3.80±0.3112.23±3.47Sham3.90±0.3111.03±3.64Model0.60±0.41**##28.66±6.89**##JiJidecoction-treated4.18±1.37△△15.33±7.27△△

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vssham group;

△△P<0.01vsmodel group

目前已有的报道表明，“交通心肾”对失眠、肠道预激综合征、慢性肾功能不全、心肾综合征等具有显著地治疗效果，但其现代医学的理论基础仍然不清楚，也未见报道。国内外研究发现，中枢神经系统内活性氧产物(reactive oxygen species，ROS)的产生超过内源性的抗氧化防御机制的清除能力，进而引起的氧化应激，是VD发病的重要机制[10-12]。本研究所使用的方剂既济汤中黄连[13]具有抗脑损伤的功效，益智仁[14]可以益智健脑，远志[15]具有抗痴呆和脑保护作用；黄连[16]、益智仁[17]、枸杞子[18]、菟丝子[19]、熟地[20]、远志[21]、黄芩[22]具有较强的抗氧化活性。那么既济汤对VD的保护效应是否与其缓解脑内的氧化应激有关？因此实验中进一步检测了脑组织匀浆中SOD活性和MDA含量。结果显示，VD模型组动物脑组织匀浆中，SOD活性显著降低，MDA含量显著升高；既济汤治疗组小鼠脑组织中SOD活性增加，MDA含量下降。这些数据表明，既济汤对VD小鼠认知行为的保护作用可能与其降低脑内的氧化应激水平有关。因此从现代医学的观点看，既济汤“交通心肾”作用，可能与其对机体各个脏器氧化还原状态的调整有关，但这一观点需要进一步的证据支持。中药汤剂大多是混合性中药成分，其作用靶点和机制远比单一化学药物复杂，既济汤抑制VD小鼠脑内氧化应激效应，是通过减少ROS产生还是阻断了其后的氧化还原信号转导实现的，尚需进一步探讨。

总之，本研究表明既济汤可显著改善VD小鼠的认知功能，其机制可能与其抑制脑内的氧化应激有关。今后，既济汤有效成分、作用靶点和发生机制的进一步阐明，将为相关疾病的防治提供新思路。

[1] Sudduth TL, Powell DK, Smith CD,etal. Induction of hyperhomocysteinemia models vascular dementia by induction of cerebral microhemorrhages and neuroinflammation[J].JCerebBloodFlowMetab, 2013, 33(5): 708-715.

[2] 曲艳吉, 卓 琳, 王华丽, 等. 1980-2011 年中国社区 55 岁及以上人群中血管性痴呆流行病学的 Meta 分析[J]. 中国卒中杂志, 2013, 8(7): 533-543.

[3] 韩 飞, 荆志伟, 于亚南, 等. 中药有效成分治疗血管性痴呆的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(7): 273-276.

[4] Himori N, Watanabe H, Akaike N,etal. Cerebral ischemia model with conscious mice: involvement of NMDA receptor activation and derangement of learning and memory ability[J].JPharmacolMethods, 1990, 23(4): 311-327.

[5] 李 洁, 余小燕. 肉碱对大鼠力竭运动后心肌线粒体呼吸链功能及抗氧化能力的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2012, 28(5): 405-409.

[6] 马 琳. 论老年性痴呆与心肾不交[J]. 世界中西医结合杂志, 2010, 5(9): 739-740.

[7] 郭闫葵, 浦家祚, 赵世珂, 等. 肾虚与血管性痴呆的相关研究[J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2010, 8(8): 985-987.

[8] 全世建, 何树茂, 钱莉莉. 交泰丸交通心肾治疗失眠作用机理研究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2011, 13(8): 12-14.

[9] 车玉琴, 任玉峰, 高 杰. IGF-Ⅱ对大鼠脑缺血/再灌注损伤后海马TNF-α含量的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2009, 25(2): 249-250,276.

[10]马婧怡, 张万鑫, 陈 虹, 等. 松果菊苷对血管性痴呆大鼠氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2014, 30(5): 638-642.

[11]Aliev G, HoreckJ, Vanová O,etal. The three-vessel occlusion as a model of vascular dementia-oxidative stress and mitochondrial failure as an indicator of brain hypoperfusion[J].SystBiolFreeRadicAntioxid, 2014: 2023-2032.

[12]Kim HA, Miller AA, Drummond GR,etal. Vascular cognitive impairment and Alzheimer’s disease: role of cerebral hypoperfusion and oxidative stress[J].NaunynSchmiedebergsArchPharmacol, 2012, 385(10): 953-959.

[13]亓 丹. 黄连的药理作用及临床使用研究[J]. 中华医药杂志, 2004, 4(9): 186-188.

[14]崔开宇, 王 平, 游秋云. 益智仁挥发油对大鼠快动眼睡眠剥夺恢复后脑组织氨基酸类神经递质含量及其受体表达的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(4): 223-227.

[15]刘大伟, 康利平, 马百平. 远志化学及药理作用研究进展[J]. 国际药学研究杂志, 2012, 39(1): 32-36.

[16]宋 珏, 路 通, 谢 林, 等. 黄连解毒汤抗氧化作用的血清药理学研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16 (4): 118-122.

[17]石绍淮, 刘 冰, 李 欢, 等. 超高效液相色谱法同时测定益智中 4 种抗氧化活性成分[J]. 中国药学杂志, 2014, 49(7): 592-595.

[18]冯美玲, 王书芳, 张兴贤. 枸杞子的化学成分研究[J]. 中草药, 2013, 44(3): 265-268.

[19]刘海云, 吴欢欢, 何志坚. 菟丝子提取物对亚急性衰老小鼠的抗衰老作用研究[J]. 江西中医学院学报, 2013 (6): 72-74.

[20]安红梅, 史云峰, 胡 兵, 等. 熟地黄对 D-半乳糖衰老模型大鼠脑衰老的作用研究[J]. 中药药理与临床, 2008, 24(3): 59-60.

[21]Shi T, Li Y, Jiang Y,etal. Isolation of flavonoids from the aerial parts of Polygala tenuifolia Willd. and their antioxidant activities [J].JChinPharmSci, 2013, 22(1): 36-39.

[22]辛文妤, 宋俊科, 何国荣, 等. 黄芩素和黄芩苷的药理作用及机制研究进展[J]. 中国新药杂志, 2013, 22(6): 647-653.

Effects of Jiji decoction on the cognitive function and oxidative stress in mice with vascular dementia induced by cerebral ischemia/reperfusion

LIU Feng-xi1, NIU Kai2, WU Zhi-gang1, XUE Gui-ping1, YANG Jian-ming1, ZHANG Dan-shen1△

(1. Department of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000; 2. Santa (Zhangjiakou) Pharmaceutical Co., LTD, Zhangjiakou 075000,China)

Objective: To determine the effects of Jiji decoction (Traditional Chinese Medicine) on the cognitive function and oxidative stress in mice with vascular dementia (VD) induced by cerebral ischemia/reperfusion. Methods: Thirty-two mice were randomly divided into normal group (n=8), sham group (operation, but no cerebral ischemia/reperfusion,n=8), model group (vascular dementia model induced by cerebral ischemia/reperfusion,n=8), and Jiji decoction- treated group (vascular dementia model plus treatment with Jiji decoction,n=8). Fourteen days of treatment after operation, the cognitive behavior was measured in step-through test, spatial probe test and platform test. Afterwards, to assess the levels of oxidative stress, the activity of superoxide dismutase(SOD) and content of malonaldehyde (MDA) in brain of these mice were measured. Results: Data from step-through test indicated that the escaping latency of Jiji decoction- treated group was prolonged and the error counts were decreased significantly (P<0.01) compared with those of model group. Data from spatial probe test indicated that the time of entering darkroom, the time of climbing height and the time of entering bright room in Jiji decoction-treated group were shortened and the counts of climbing height were increased (P<0.05～0.01) significantly compared with those of model group. Data from platform test showed that the escaping latency of Jiji decoction- treated group was prolonged significantly (P<0.01) compared with that of model group. Compared with normal and sham group, the activity of SOD was decreased and the content of MDA was increased in model group significantly (P<0.01). Compared with those of model group, the levels of SOD and MDA in Jiji decoction- treated group were improved significantly (P<0.01). Conclusion: Jiji decoction could improve cognitive function of VD mice. Its mechanism might be related with the inhibition of oxidative stress in the brain.

Jiji decoction; vascular dementia; cognitive function; oxidative stress

河北省教育厅科学研究项目(Z2011311)；张家口市科技局研究项目(1101090D)；河北北方学院校级青年基金项目(Q201131)

2014-09-24 【修回日期】2015-02-05

R364.1；R28

A

1000-6834(2015)02-170-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.020

△【通讯作者】Tel: 18931316068； E-mail: zhangjk1979@163.com