当归精油对大鼠实验性哮喘的干预作用*

王志旺， 李荣科， 蔺兴遥,2， 任 远,2， 刘雪枫， 程小丽， 王瑞琼

(1. 甘肃中医学院, 兰州 730000; 2. 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室, 兰州 730000)



当归精油对大鼠实验性哮喘的干预作用*

王志旺1,2△， 李荣科1， 蔺兴遥1,2， 任 远1,2， 刘雪枫1， 程小丽1， 王瑞琼1

(1. 甘肃中医学院, 兰州 730000; 2. 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室, 兰州 730000)

目的：研究当归精油对实验性哮喘大鼠模型的平喘作用及对肺脏IL-10与Foxp3表达的影响。方法：取雌性大鼠随机分6组(n=9)，通过注射卵白蛋白(OVA)和氢氧化铝致敏与OVA雾化吸入激发复制哮喘模型，经当归精油干预，观测哮喘大鼠肺功能、哮喘行为学、支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-10(ELISA法)以及肺组织Foxp3(免疫组化法)的表达。结果：40～160 mg/kg当归精油可明显改善哮喘大鼠的肺功能，减轻吸入混合激发液后的哮喘等行为学症状，提高BALF中IL-10的水平及肺组织Foxp3蛋白的表达强度。结论：当归精油具有一定的平喘作用，而改善Treg细胞免疫功能异常低下是其作用机制之一。

当归；精油；哮喘；IL-10；Foxp3；大鼠

当归(Angelica Sinensis(oliv.) Diels)是常用中药之一，素有“十方九归”之称。自《神农本草经》谓当归“主咳逆上气”以来，当归治疗哮喘的机制与临床应用在历代中医药著作中有详细的记载，如《本草经疏》谓当归“甘以缓之，辛以散之润之，温以通之畅之。活血补血之要药，故主咳逆上气也。”药理实验显示当归精油对豚鼠离体气管平滑肌有明显的解痉作用[1]，本次研究以肺功能、哮喘行为学以及肺组织Foxp3表达等为指标，探讨当归精油对哮喘大鼠的平喘作用及其对相关转录因子的影响，为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

当归精油，甘肃省岷县康达药业开发有限责任公司生产；Grade V卵白蛋白(OVA)，sigma公司生产；地塞米松片(dexamethasone)，浙江仙琚制药股份有限公司生产，批准文号：国药准字H33020822，产品批号：111068；IL-10测试盒(ELISA)，深圳达科为生物技术有限公司产品，产品批号E3000-1309-2；Foxp3免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司生产，产品批号：39545；吐温-80，上海大众制药厂，生产批号：70093。实验时，将当归精油及地塞米松配制成乳状液，另配制0.8%吐温-80作为空白对照液，冷藏30 d内使用。

1.2 仪器

超声雾化器(420AI)，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司生产；高速冷冻离心机(TGL-16G)，上海安亭科学仪器厂；分光光度计(722型)，上海第三分析仪器厂产品；Sartorius电子分析天平(BS1103型)，北京赛多利斯仪器有限公司；恒温水浴锅(HH-S型)，金坛市正基仪器有限公司；医学图像分析系统(BI-2000型)，成都泰盟科技有限公司；光学显微镜(CH-212型)，日本Olympus。

1.3 动物

雌性SD大鼠，体质量115～145 g，SPF级，由甘肃中医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(甘)2004-0006；甘肃中医学院实验动物中心饲养。

1.4 筛选动物

将大鼠放于密闭玻璃箱内(40 cm×30 cm×20 cm)，吸入超声雾化的0.5%组胺，观察大鼠吸入组胺后的呼吸变化情况，选择吸入组胺后20 s内出现呼吸急促、前肢缩抬、点头或腹式呼吸等有哮喘症状的大鼠作为模型用鼠。

1.5 分组、造模及给药

取上述筛选合格的雌性大鼠[2-4]54只，按体重分层随机分为6组(n=9)，自由进食去OVA的特制饲料。致敏时，各组大鼠在第1天和第8天用新鲜配制的OVA 50 mg(5%)和含100 mg(10%)氢氧化铝凝胶的生理盐水混悬液共1 ml，于大鼠两后足跖和两侧腹股沟四计点做皮下注射，每点0.2 ml，同时ip 0.2 ml；正常对照组以生理盐水代替致敏。第15天开始激发，将大鼠放入玻璃容器内，以雾化量0.8 ml/min吸入1%OVA，每天1次，一次20 min，连续28 d，正常对照组用生理盐水代替激发。每次激发前1 h，各组大鼠ig相应的药物10 ml/kg，即当归精油高剂量组(High)、中剂量组(Middle)与低剂量组(Low)分别ig当归精油160 mg/kg、80 mg/kg与40 mg/kg，地塞米松组(Dexamethasone) ig地塞米松0.5 mg/kg，正常对照组(Control)与模型对照组(Model) ig空白对照液。每天1次，连续28 d。实验过程中地塞米松组有一只大鼠因灌胃不慎而死亡，其余53只完成实验。

1.6 观测指标

1.6.1 哮喘大鼠吸入混合激发液后的行为学观察 实验进行到第27天与第41天，大鼠例行吸入OVA激发6 h后，观察吸入2%乙酰胆碱与0.2%组胺混合激发液后15 min内大鼠的打喷嚏次数、抓鼻次数与哮喘发作及其程度，参照相关文献[5,6]，对哮喘发作程度进行评分，即有轻度喘息(躁动或静伏)者计为3分，明显喘息(呼吸困难，腹式呼吸、呼吸急促呈点头状但幅度较小、迅速抬头做喘息状)者计为6分，严重喘息(呼吸极度困难，呼吸急促呈点头状幅度大频率高或反应迟钝)者计为9分。

1.6.2 大鼠肺功能检测 实验进行到第2天与第42天，进行动物肺功能检测，将大鼠放入肺功能仪的密闭体积描记箱中，待动物安静后，记录哮喘大鼠呼吸功能相关指标。

1.6.3 BALF中IL-10的测定 大鼠最后一次激发24 h后，用2%戊巴比妥钠麻醉，处死大鼠，分离气管，参考相关文献[8]，结扎左支气管，提取支气管肺泡灌洗液(BALF)，3 000 r/min离心10 min，取上清液按ELISA试剂盒说明测定大鼠BALF中IL-10的水平。1.6.4 肺组织Foxp3的表达 处死大鼠后，打开胸腔，于固定位置取未灌洗的左肺组织，10%甲醛固定，石蜡切片，免疫组化染色，在光学显微镜下观察Foxp3的表达并进行半定量分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 当归精油对哮喘大鼠吸入混合激发液后行为学的影响

随着实验的进行，大鼠激发后出现明显的打喷嚏、抓鼻甚至哮喘发作等哮喘行为学症状；实验中、后期在吸入OVA激发6 h后，观察大鼠吸入乙酰胆碱与组胺混合激发液后的哮喘行为学症状。实验结果显示，哮喘模型大鼠吸入混合激发液后打喷嚏次数与抓鼻次数明显增加，多数出现程度不同的哮喘症状，与正常对照组比较有统计学意义；经40～160 mg/kg当归精油干预后，大鼠哮喘行为学指标有不同程度的缓解(P<0.5, 0.01，表1、表2)。

2.2 当归精油对哮喘大鼠肺功能的影响

实验进行至第28天与第42天(即激发第14天与第28天)测定大鼠肺功能。实验数据显示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠呼气峰流量显著降低(P<0.01，表3)；经当归精油干预后，哮喘大鼠的呼气峰流量明显增加(P<0.05)；但呼气时间无明显变化。

2.3 当归精油对哮喘大鼠BALF中IL-10的影响

与正常对照组比较，哮喘模型大鼠BALF中IL-10的含量显著降低(P<0.01，表4)；经当归精油防治后，IL-10的含量上升，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05, 0.01)。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Tab. 2 Effect of VOA on asthmatic behaviors of rat administering excited liquid in 41 day (times, ±s)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Tab. 3 Effect of VOA on respiratory function of asthmatic rats ±s)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.4 当归精油对哮喘大鼠肺组织中Foxp3表达的影响

在高倍视野下，转录因子Foxp3经免疫组化染色后阳性反应者为棕蓝色颗粒沉着，大鼠肺组织转录因子Foxp3主要表达于气道周围及肺组织中淋巴细胞等细胞胞浆与细胞核内(图1A)。哮喘模型组大鼠肺组织Foxp3的表达强度明显减弱(图1B)；而当归精油各剂量组Foxp3的表达强度有所增加(图1D、图1E、图1F)。同时，采用显微医学图像分析系统对Foxp3蛋白表达强度进行半定量分析，结果显示，模型对照组大鼠肺组织Foxp3表达的平均光密度值显著减小，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.05，表4)；经当归精油干预后，Foxp3的表达强度明显增强，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

哮喘(支气管哮喘)是多种原因参与的气道慢性炎症性疾病，虽然近年来采取多种治疗措施(包括综合抗炎治疗方案)，但其发病率及死亡率并无明显降低[7]，因此研发新的治疗方法(包括新药)非常必要。

Fig. 1 Effect of VOA on Foxp3 expression in lung tissue of asthmatic rats (×40) A: Control group; B: Model group; C: Dexamethasone group; D: High dose of VOA group; E: Middle dose of VOA group; F: Low dose of VOA group

在《神农本草经》中记载中药当归有“主咳逆上气”的功效，近年来临床研究显示，当归精油具有防治哮喘的作用，当归精油丸、当归喘痛宁等制剂在治疗哮喘方面取得了比较好的疗效[8,9]。本课题组在前期离体实验的基础上，采用卵蛋白复制大鼠哮喘模型，观测当归精油防治哮喘的作用及其可能机制。

Tab.

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vslow dose of VOA group

过敏性哮喘临床上除了哮喘的症状外，还有过敏的症状，本次实验在激发的中、后期，观测大鼠吸入组胺与乙酰胆碱混合激发液后的哮喘行为学变化，结果显示当归精油对哮喘大鼠打喷嚏、抓鼻及哮喘发作症状等有明显的缓解作用。肺功能的衰减是哮喘致病的关键因素，本实验在激发的中、后期对哮喘大鼠的肺功能进行监测，结果提示当归精油对哮喘大鼠呼气峰流量的减小有明显的抑制作用。哮喘大鼠吸气容易而呼气难，致使呼气时间有延长的趋势；但另一方面，哮喘大鼠由于机体缺氧，交感神经兴奋，呼吸频率加快，呼吸一次的时间缩短，使呼气时间有缩短的趋势，故在整个实验过程中呼气时间没有明显变化。

哮喘是多种炎性细胞参与的气道慢性炎症性疾病，Treg细胞(regulatory T cells, 调节性T细胞)约占外周CD4+T细胞的5～10%，是一类调节机体免疫反应的T细胞亚群。近年来研究显示，Treg细胞功能低下导致效应T细胞过度增殖是哮喘的发病机制之一[10,11]。Treg细胞的特征性标志是叉状头/翼状螺旋转录因子(forkhead/winged helix transcription factor,Foxp3)，Foxp3特异性表达于Treg细胞并对其发育和功能起重要的作用，Foxp3缺乏可导致CD4+CD25+Treg细胞功能的缺失，故Foxp3被认为是CD4+CD25+Treg细胞功能的主开关[12]。作为诱导型Treg细胞(iTreg)之一的Tr1细胞能分泌IL-10，而IL-10能够抑制效应T细胞(包括Th2、Th17等)的过度活化，对哮喘过程中偏亢的免疫反应起重要的负调节作用[13]。本次实验结果提示，当归精油对哮喘动物模型BALF中IL-10的低水平、肺组织中Foxp3的低表达有一定的改善作用。

总之，当归精油具有一定的平喘抑喘作用，而提高IL-10与Foxp3的表达、改善Treg细胞免疫功能异常低下可能是其作用机制之一。

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Effect of Volatile Oil of Radix Angelicae Sinensis on experimental asthma in rats

WANG Zhi-wang1,2△, LI Rong-ke1, LIN Xing-yao1,2, REN Yuan1,2, LIU Xue-feng1,CHENG Xiao-li1, WANG Rui-qiong1

(1． Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2． Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicine of Gansu Province, Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective: To study the effects of Volatile Oil of Radix Angelicae Sinensis (VOA)on experimental asthma in rat model based on abnormal immune functions of Treg cells. Methods: After grouping, the asthmatic rats were developed through injecting OVA and AI(OH)3for sensitization and then administering OVA aerosol for challenge, and the respiratory functions, asthmatic behaviors, IL-10 levels in broncho-alveolar lavage fluid(BALF) (ELISA) and Foxp3 expression (immunohistochemistry) in lung of asthmatic rats were observed. Results: VOA at the doses of 40～160 mg/kg could improve the respiratory functions and the asthmatic behaviors, and upgrade IL-10 levels in BALF and Foxp3 expression in lung of asthmatic rats. Conclusion: VOA has some effects of anti-asthma and one of the mechanisms is to improving the lower immune functions of Treg cells.

Radix Angelicae Sinensis; Volatile Oil; asthma; IL-10; Foxp3; rat

国家自然科学基金项目(81460668)；甘肃省自然科学基金项目(1310RJZA086)；甘肃省中药药理与毒理学重点实验室开放基金项目(ZDSYS-KJ-2013-008)

2015-01-15 【修回日期】2015-02-07

R562.25；R285.5

A

1000-6834(2015)02-107-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.003

△【通讯作者】Tel: 0931-8765395; E-mail: wzw0933@126.com