百草枯对活性氧类物质的产生和中性粒细胞凋亡的影响*

秦开秀， 李醇文， 方 艳， 余 雷， 王晓龙

(重庆医科大学附属第二医院急救部， 重庆 400010)



百草枯对活性氧类物质的产生和中性粒细胞凋亡的影响*

秦开秀， 李醇文， 方 艳， 余 雷， 王晓龙△

(重庆医科大学附属第二医院急救部， 重庆 400010)

目的：探讨百草枯(PQ)对活性氧类物质(ROS)和中性粒细胞凋亡的影响及可能机制。方法：离体培养健康成人中性粒细胞，给予不同浓度百草枯刺激后培养6～24 h,流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡率及ROS含量，Western blot检测信号蛋白核因子kappa B(NF-кB)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase 3)；给予ROS、NF-κB拮抗剂后，再次检测中性粒细胞凋亡率及信号蛋白含量。结果：PQ可明显促进ROS产生及抑制中性粒细胞凋亡，这种效应可被ROS抑制剂二联苯碘(DPI)及NF-кB抑制剂四氢吡咯二硫代氨基甲酯(PDTC)逆转。同时，PQ能促进NF-κB表达增加，而Caspase 3表达则受到明显抑制。结论：百草枯是强力的ROS诱导剂，并能抑制中性粒细胞凋亡，其机制可能与NF-κB活化，进而抑制Caspase 3表达有关。

百草枯；活性氧类物质；中性粒细胞；凋亡

百草枯(paraquat,PQ)是一种强力快速的接触性除草剂，对人体具极大危害性，PQ中毒目前尚无特异的治疗方法。据文献报道[1]，PQ诱导产生的活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)是百草枯中毒的中心环节。ROS一方面直接导致细胞成份中的脂质过氧化、蛋白质破坏及DNA断裂[2]；同时ROS作为细胞内信号转导分子，参与了中性粒细胞凋亡的调节过程[3]。已有证据表明[4]，中性粒细胞的过度活化是全身炎症反应(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)重要一环，其在肺内聚集、扣押及凋亡延迟导致炎症反应进一步被放大的“瀑布效应”，从而进一步发展成为急性肺损伤。严重PQ中毒会导致SIRS发生，而中性粒细胞是参与SIRS过程中最为重要的细胞之一。正常情况下，中性粒细胞在循环中生存时间仅8～20 h，其正常凋亡是炎症局限的必要一环。大量文献表明，SIRS条件下中性粒细胞凋亡显著延迟[5]，但PQ对中性粒细胞凋亡影响鲜有研究报道。我们通过离体培养健康人中性粒细胞，PQ刺激后检测ROS及中性粒细胞凋亡情况，并通过多种信号转导分子抑制剂进一步探讨ROS对中性粒细胞凋亡影响及可能信号通路，为更深入探究PQ所致SIRS奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

20% PQ购于天津三农化工有限公司；NADPH氧化酶抑制剂二联苯碘(diphenyleneiodonium，DPI)，核因子кB(nuclear factor kappa B,NF-κB)抑制剂四氢吡咯二硫代氨基甲酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)，购自Sigma公司；ROS 检测试剂盒购自美国细胞生物实验公司；荧光素标记的连接素V-碘化丙锭(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，FITC-PI)双染色凋亡试剂盒购于美国BD公司；NF-κB pP65、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase 3)单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 中性粒细胞分离培养及处理

2周内未服用药物的健康成人志愿者为献血员，参照文献[4]进行中性粒细胞分离纯化。台盼蓝染色鉴定分离中性粒细胞活性超过98%，然后以1.6×105cells/ml密度培养于D-PBS(含Ca2+、 Mg2+、 1 g/L葡萄糖、4 mmol/L碳酸氢钠盐)。中性粒细胞然后加入终浓度为5, 50 or 100 μmmol/L PQ培养6～24 h,流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡率，ROS试剂盒检测ROS含量。后续实验中，实验组予以50 μmmol/L DPI 和/或10 μmmol/L PDTC分别与中性粒细胞孵育30 min后，再予5 μmmol/L PQ刺激6 h,以生理盐水(normal saline,NS)作为阴性对照、未加入DPI及PDTC为阳性对照，检测中性粒细胞凋亡率、ROS、NF-κB及Caspase 3含量。以上每个浓度重复4次，取其均值为最终结果。

1.3 中性粒细胞ROS检测

采用美国细胞生物实验公司OxiSelectTM ROS检测试剂盒进行检测。首先吸除中性粒细胞培养液，DPBS冲洗3次，加入100 μl 1×DCFH-DA 37℃培育45 min，再予DPBS冲洗3次，流式细胞仪于488 nm激发光波长下检测荧光强度。

1.4 中性粒细胞凋亡检测

应用荧光素标记的Annexin V-FITC/PI 试剂盒进行检测。培养的中性粒细胞用冰冷的PBS冲洗2遍，然后用结合缓冲液悬浮。然后按照说明书加入Annexin V-FITC 和PI进行标记，1 h后上流式细胞仪检测。以Annexin V-FITC阳性，而PI阴性表示凋亡细胞。凋亡细胞占检测细胞总数的百分比为凋亡率。

1.5 Western blot 检测

蛋白提取液提取中性粒细胞蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。40 μg提取蛋白于12% SDS-PAG上电泳，然后半干转移至硝酸纤维膜上。5%(w/v) 脱脂奶粉封闭，加入NF-κB及Caspase 3单克隆抗体(1∶1 000)，以β-actin作为内参照，4°C过夜。1∶5 000辣根过氧化酶标记的二抗处理后，用化学发光法进行检测。测得结果与内参照相比的比值作为最终结果。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 PQ对中性粒细胞凋亡的影响

与阴性对照组(NS )相比，5 μmmol/L PQ及以上浓度时，同时点中性粒细胞凋亡比例显著下降(P<0.05)，但这种抑制效应并未随PQ浓度增加而呈现浓度依赖性(表1)。

Group6h12h18h24hNS66.3±4.677.5±5.783.4±8.293.5±8.85μmol/L44.6±4.8*55.3±6.2*66.0±7.2*78.4±7.4*50μmol/L42.6±3.6*51.8±4.6*60.4±6.1*81.8±6.2*100μmol/L37.8±3.9*50.2±3.8*56.4±5.0*81.9±5.3*

NS: Normal saline； PQ: Paraquat

*P<0.05vsNS group

2.2 PQ诱导产生的ROS对中性粒细胞凋亡的影响

加入不同浓度PQ组在6, 12, 18 及 24 h时点，中性粒细胞产生的ROS均较对照组显著升高(P<0.05)，但在同一时间点不同浓度PQ组间差异无显著性(表2)。

为进一步确定PQ对中性粒细胞凋亡的影响是否通过ROS而产生，给予50 μmol/L ROS拮抗剂DPI和/或10 μmol/L NF-κB拮抗剂PDTC预处理后，再予5 μmol/L PQ刺激6 h，ROS含量显著下降,而中性粒细胞凋亡率则明显上升(P<0.05，表3)。 PQ作用下，无论单纯加入DPI或PDTC，或二者联合，对ROS产生及中性粒细胞凋亡率影响无显著性差异。

Group6h12h18h24hNS31.4±6.530.5±7.128.7±7.326.2±7.55μmol/L63.8±11.5*64.9±12.5*60.1±11.3*56.8±13.8*50μmol/L67.5±12.1*51.8±4.6*62.4±14.1*60.4±13.8*100μmol/L2.3±13.9*75.0±3.8*67.3±12.9*65.3±14.5*

NS： Normal saline； ROS： Reactive oxygen species； PQ： Paraquat

*P<0.05vsNS group

2.3 NF-κB、Caspase 3 参与ROS诱导的中性粒细胞凋亡延迟

PQ刺激后，NF-κB(pP65)均较对照组明显升高，而DPI及PDTC可以显著抑制NF-κB(pP65)的表达；与此相对应的是，Caspase 3在PQ刺激后其活性成份明显减低，再予以ROS抑制剂DPI及NF-κB抑制剂PDTC后Caspase 3含量增加(表4，图1)。

GroupROS Apoptosis(%) NS34.5±3.267.3±6.8PQ62.6±7.4*41.5±4.5*PQ+DPI44.1±2.6#52.3±5.7#PQ+PDTC47.6±1.8#54.6±5.8#PQ+DPI+PDTC45.0±1.9#58.7±6.1#

NS： Normal saline； PQ： Paraquat； DPI： Diphenyleneiodonium； PDTC： Pyrrolidinedithiocarbamate； ROS： Reactive oxygen species

*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsPQ group

GrouppP65Caspase3NS0.280±0.0900.230±0.046PQ0.615±0.200*0.033±0.015*PQ+PDTC0.060±0.025*#0.710±0.036*#PQ+DPI0.436±0.194*#0.670±0.035*#

NS: Normal saline; PQ: Paraquat; DPI:Diphenyleneiodonium; PDTC: Pyrrolidinedithiocarbamate； NF-κB： Nuclear factor kappa B

*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsPQ group

Fig. 1 NF-κB,Caspase 3 expression in each group NS： Normal saline； PQ： Paraquat; DPI： Diphenyleneiodonium； PDTC： Pyrrolidinedithiocarbamate； PQ/PDTC: PQ plus PDTC; PQ/DPI: PQ plus DPI

3 讨论

业已证实，PQ毒性与其诱导产生的ROS密切相关，中性粒细胞通过“呼吸爆发”成为重要的ROS来源。与此同时，中性粒细胞还通过释放TNF-α、IL-10等炎症介质导致SIRS的发生。因此，可能基于上述原因，中性粒细胞数目升高成为PQ中毒重要的早期死因之一[6]。而中性粒细胞凋亡延迟无疑使这一病理生理过程进一步恶化。那么，作为信号分子的ROS对中性粒细胞凋亡的影响在PQ中毒过程中或许有重要作用。

有研究认为，ROS对中性粒细胞凋亡存在浓度相关性，低浓度抑制凋亡，高浓度促进凋亡[7]；也有研究表明，ROS可以明显抑制中性粒细胞凋亡而与其浓度无关[8]。PQ条件下产生的ROS对中性粒细胞凋亡影响尚无报道。本研究发现，PQ可以明显抑制中性粒细胞凋亡，而这种抑制作用在实验范围的PQ浓度内未呈现浓度依赖性。实验中给予PQ后，ROS含量明显上升，给予ROS抑制剂DPI之后ROS含量下降，中性粒细胞凋亡增加，则可以证实PQ是导致ROS产生的诱导剂，而PQ诱导产生的ROS是中性粒细胞凋亡延迟的重要原因。同时，我们前期研究发现[9]，PQ作为强烈的炎症刺激因子，可促进TNF-α等炎症介质大量释放，而TNF-α等炎症介质又是强烈的ROS诱导剂，可能正是由于这种导致ROS产生的正反馈机制的存在，实验中ROS的产生与PQ未呈现浓度依赖关系，而呈现出“全”或“无”的特点。

NF-κB是一类能与多种细胞因子基因启动子部位的κB位点结合并增强这些基因转录的蛋白质。研究表明[9]，PQ可促进TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的大量释放。而这些炎症介质的释放与NF-κB的活化和表达增强有明显关系[10]。NF-κB与其抑制因子IκBα以异源二聚体形式结合存在于胞浆中，受外界刺激后IκBα发生降解，NF-κB转位至核内，发挥其效应[4]。本实验发现PQ可促进p65表达，DPI能抑制其表达，表明PQ条件下NF-κB的激活与ROS密切相关。此外，NF-κB化学抑制剂PDTC可以促进PQ条件下的中性粒细胞凋亡则表明NF-κB参与了抑制中性粒细胞凋亡环节。

Caspase 3是死亡受体途径或线粒体途径致细胞凋亡信号通路的关键节点和交汇点，是凋亡信号的执行者。Hinz[11]通过构建腺病毒转染H/RS细胞表达NF-κB抑制剂IκBα后，观察到 Caspase 3大量释放，同时伴有大量细胞凋亡，表明NF-κB可通过抑制Caspase 3而抑制细胞凋亡。本次实验研究也发现，PQ可以显著抑制Caspase 3含量，而给予NF-κB化学抑制剂PDTC后Caspase 3活性明显增加，中性粒细胞凋亡率相应增加。由此，我们推测，NF-κB参与抑制中性粒细胞凋亡的下游环节是由于其对Caspase 3的抑制。

总之，本实验首次探讨了PQ诱导的ROS对中性粒细胞凋亡的影响及可能的信号通路。ROS-炎症介质-NF-κB可能以级联形式导致炎症反应不断放大，并进一步抑制Caspase 3的活性，导致中性粒细胞凋亡延迟，进而使炎症反应进行性恶化，这也许从一定程度上解释了临床上PQ中毒高病死率的原因，为PQ中毒探索新的思路具有一定意义。

[1] Valko M, Leibfritz D, Moncol J,etal. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J].IntJBiochemCellBiol, 2007, 39(1): 44-84.

[2] 王燕萍， 潘晓东， 姜苏原， 等. 氧化应激可通过NF-κB-iNOS-NO信号通路诱导小鼠胰岛β细胞凋亡[J]. 中国应用生理学杂志, 2009, 25(2): 255-259.

[3] Lundqvist-Gustafsson H, Bengtsson T. Activation of the granule pool of the NADPH oxidase accelerates apoptosis in human neutrophils[J].JLeukocBiol, 1999, 65(2): 196-204.

[4] 王晓龙， 周向东. 核转录因子-κB抑制因子对中性粒细胞凋亡的影响[J]. 中国老年学杂志, 2010, 30(1): 194-196.

[5] 尚 东， 齐清会， 王宝枝， 等. 中性粒细胞凋亡调控基因表达异常在全身炎症反应综合征中的作用[J]. 中国危重病急救医学, 2007, 19(1): 11-13.

[6] 才 权， 刘 志. 急性百草枯中毒早期死亡相关因素分析[J]. 中华危重病急救医学, 2014, 26(6): 379-382.

[7] Rygiel TP, Mertens AE, Strumane K,etal. The Rac activator Tiam1 prevents keratinocyte apoptosis by controlling ROS-mediated ERK phosphorylation[J].JCellSci, 2008, 121(Pt 8): 1183-1192.

[8] Hampton MB, Orrenius S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis[J].FEBSLett, 1997, 414(3): 552-556.

[9] Wang X, Luo F, Zhao H. Paraquat-induced reactive oxygen species inhibit neutrophil apoptosisviaa p38 MAPK/NF-kB-IL-6/TNF-α positive-feedback circuit [J].PloSOne， 2014, 9(4): e93837.

[10]潘莹莹， 高歌心， 谢浩煌， 等. TNF-α、NF-κB在大鼠压疮深部组织损伤中的表达及其对细胞凋亡作用[J]. 中国应用生理学杂志, 2013, 29(5): 441-445.

[11]Hinz M, Loser P, Mathas S,etal. Constitutive NF-kappa B maintains high expression of a characteristic genenetwork, including CD40,CD86,and a set of antiapoptotic genes in Hodgkin/Reed-Sternberg cells[J].Blood, 2001, 97(9): 2798-2807.

Effect of reactive oxygen species induced by paraquat on neutrophil apoptosis

QIN Kai-xiu, LI Chun-wen, FANG Yan, YU Lei, WANG Xiao-long△

(Department of Emergency, the 2ndAffiliated Hospital of Chongqimg Medical University, Chongqing 400010, China)

Objective: To investigate the effect of paraquat(PQ) on reactive oxygen species(ROS) and neutrophil apoptosis and its possible signal transduction pathways. Methods: Cultured neutrophils were treated with different concentrations of PQ for 6～24 h. The apoptosis rate of neutrophils and ROS content were determined by flow cytometry. The exoressions of nuclear factor kappa B (NF-κB) and Caspase 3 were detected by Western blot. These parameters were checked again after NF-κB and Caspase 3 antagonist were applied. Results: PQ could boost ROS generation and depress neutrophil apoptosis significantly. At the same time PQ could enhance the expression of NF-κB and inhibit the expression of Caspase 3. These effects could be reversed by ROS inhibitor diphenyleneiodonium(DPI) and NF-κB inhibitor pyrrolidinedithiocarbamate(PDTC). Conclusion: PQ is a potent inducer of ROS and can inhibit neutrophil apoptosis by activating NF-κB and surpressing Caspase 3 activity.

paraquat; reactive oxygen species; neutrophils; apoptosis

重庆市卫生局基金(2013-2-036)

2014-09-15 【修回日期】2014-11-04

R557

A

1000-6834(2015)02-111-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.004

△【通讯作者】Tel: 023-63693775; E-mail: xiaolongwang126@126.com