邻苯二甲酸酯染毒哺乳期母鼠对雄性仔鼠睾丸Leydig细胞形态及功能的影响*

陈涵斌， 马 骏， 李慧敏， 牛三强， 陈显武， 陈国荣， 陈三妹， 王蓉蓉△

(1. 温州医科大学， 浙江 温州 325035； 2. 山西省大同市第三人民医院病理科， 大同 037008；3. 绍兴文理学院医学院， 浙江 绍兴 312000； 4. 温州医科大学附属第一医院病理科， 浙江 温州 325015)



邻苯二甲酸酯染毒哺乳期母鼠对雄性仔鼠睾丸Leydig细胞形态及功能的影响*

陈涵斌1， 马 骏1， 李慧敏1， 牛三强2， 陈显武1， 陈国荣4， 陈三妹3△， 王蓉蓉4△

(1. 温州医科大学， 浙江 温州 325035； 2. 山西省大同市第三人民医院病理科， 大同 037008；3. 绍兴文理学院医学院， 浙江 绍兴 312000； 4. 温州医科大学附属第一医院病理科， 浙江 温州 325015)

目的：观察邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)对哺乳期雄性仔鼠睾丸子Leydig细胞(PLC)形态和功能的影响及作用机制。方法：SD孕鼠20只，随机均分为4组(n=5)：正常对照组，低剂量组，中剂量组，高剂量组。仔鼠出生第1天起分别以0、10、100、750 mg/(kg·d) DEHP灌胃染毒母鼠，直到仔鼠出生后21 d。用化学发光法检测雄性仔鼠血清睾酮(T)水平；测量体重、睾丸重量、肛生殖器距离(AGD)；光镜及电镜下观察睾丸Leydig细胞形态结构；免疫组化方法检测睾丸类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)表达；Real-time PCR法检测睾丸胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)mRNA的表达。结果：与正常组比较，低剂量组T无明显变化，中、高剂量组血清T水平明显降低(P<0.01)。低剂量组睾丸重量增加(P<0.05)，高剂量组睾丸重量、仔鼠体重明显下降(P<0.01)；中、高剂量组AGD明显缩短(P<0.01)。低剂量组睾丸Leydig细胞明显增生，呈簇状分布；中、高剂量组睾丸Leydig细胞灶区轻度增生，高剂量组部分生精小管生精细胞层次减少、生精细胞凋亡并脱落。电镜观察各给药组Leydig细胞胞浆脂质颗粒减少，线粒体、内质网减少。低剂量组IGF-ⅠmRNA表达增高(P<0.05)；中、高剂量组睾丸StAR蛋白表达降低(P<0.05)。结论：哺乳期染毒DEHP可干扰仔鼠PLC的睾酮合成，StAR蛋白的降低和Leydig细胞的损伤可能是其机制。【关键词】 邻苯二甲酸二乙基己基酯；Leydig细胞；睾酮；胰岛素样生长因子-Ⅰ；类固醇激素合成急性调节蛋白；仔鼠

近年来，人类生殖系统肿瘤发病率的升高、青春期发育的紊乱和儿童生殖系统的畸变引起人们的关注，这些现象与环境污染有关系。邻苯二甲酸酯(diethylhexylphthalate, DEHP)作为一种增塑剂广泛用于软性聚氯乙稀的产品中。DEHP可影响雄性动物的生殖和发育，包括精子生成障碍、睾酮合成下降、精子动力改变以及胚胎畸形等[1]。

Leydig细胞是雄性生殖内分泌细胞，它产生睾丸激素-睾丸酮(T)，是唯一重要的男性激素来源[2]，DEHP可能通过多种机制对Leydig细胞的功能产生影响。

本实验通过DEHP染毒哺乳期母鼠，观察雄性仔鼠睾丸子Leydig细胞的形态学改变，检测雄性仔鼠血清睾酮的水平、睾丸IGF-Ⅰ基因mRNA表达和StAR蛋白的表达，探讨DEHP对子Leydig细胞形态与功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理

自然受孕SPF级SD母鼠20只(温州医科大学实验动物中心提供)，随机均分为4组(n=5)：正常对照组、DEHP低剂量组、中剂量组、高剂量组。后3组从仔鼠出生第1天起给予母鼠不同剂量的DEHP (SIGMA-ALDRICH公司)和玉米油混合物0.5 ml/d灌胃，直到仔鼠出生后21 d。DEHP实际用量为：低剂量组10 mg/(kg·d)、中剂量组100 mg/(kg·d)、高剂量组750 mg/(kg·d)；正常对照组给予0.5 ml/d 玉米油(市售精致玉米油)。最终进入实验的仔鼠除低剂量组15只外，其余均为17只。

1.2 血清睾酮检测

取上述各组雄性仔鼠，股动脉取血2 ml，4 000 r/min离心15 min，吸取上清液，避免溶血，-20℃冰箱保存备用。采用酶免疫发光分析竞争法(Unicel Dxi800睾酮测定试剂盒，美国Beckman Coulter公司)测血清睾酮的含量。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 仔鼠整体检查

麻醉后称量雄鼠体重，量取肛生殖器距离(anogenital distance，AGD)，股动脉取血，处死动物。解剖后取出睾丸。左侧睾丸滤纸吸去血液，电子天平称重，做好记录。右侧睾丸取出后立即转入液氮中，随后冻存于-80℃冰箱，供以后测量基因使用。

1.4 睾丸形态学观察

1.4.1 HE染色标本制备及观察 沿左侧睾丸最大横断面切开，置于4℃预冷的Bouin液中固定18～24 h，取材，经常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规制片，HE染色，中性树胶封固。光镜下观察睾丸的组织结构。

1.4.2 电镜标本制备及观察 每组随机选择2例新鲜睾丸标本，冰上切成小块，约1 mm×1 mm×1 mm大小，迅速置于2.5%戊二醛4℃固定1 h，锇酸后固定，常规PBS漂洗，丙酮梯度脱水，Epon812包埋，半薄切片定位后，RMC-XL超薄切片机切片，铅铀双重染色，H-7500型透射电镜下观察超微结构改变。

1.5 IGF-Ⅰ 基因Real Time PCR

取-80℃冰冻保存的睾丸组织100 mg加1 mol/L Trizol抽提总RNA。取M-MuLV (Fermentas公司)逆转录合成cDNA(20 μl)。IGF-Ⅰ、Rps16(内参照)基因扩增引物由美国洛克菲勒大学人口委员会葛仁山教授设计，Invitrogen公司上海办事处合成。Real time PCR反应液(50 μl)配置：采用宝生物工程(大连)有限公司PCR试剂，其中SYBRpremixExTaqTM(2×)25 μl、IGF-Ⅰ 基因、Rps16内参照上下游引物各1 μl、ROXRefereneeDye(50×) 1 μl、DNA模版4 μl、dH2O(灭菌蒸馏水) 18 μl。PCR引物序列见表1。每个样本都做3管扩增，结果取平均值。反应条件：95℃10 s、95℃5 s、60℃30 s，共40个循环。仪器自动给出每个标本的Ct值。数据处理用基因的相对定量法。最终结果以处理组基因的平均相对含量，即2-(平均△△Ct)表示(表1)。

Tab. 1 The primer of rat IGF-Ⅰ, Rps16

1.6 StAR蛋白免疫组织化学染色 (Envision二步法)

睾丸组织石蜡切片，按Envision二步法说明书进行染色。StAR为兔多抗，(稀释至1∶300)，购自Santa Cruz Biotechnology,Inc.公司。兔二抗购于北京中杉金桥生物试剂有限公司。以0.01 mol/L的磷酸缓冲液(PBS)代替一抗进行阴性对照。结果判定：StAR蛋白均定位于Leydig细胞的胞浆，胞浆内见棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片随机选择4个高倍镜下睾丸间质视野(×200)，应用image-pro plus6.0图像分析软件测定阳性部位的平均吸光度(mean optical density, MOD)，用以代表阳性部位的蛋白表达水平，计算10个MOD值的平均值作为该片的MOD值。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 血清睾酮水平

中、高剂量组血清睾酮水平分别为(4.14±1.82)、(3.83±1.80)nmol/L均明显低于正常组(6.65±1.96)和低剂量组(6.56±2.06，P<0.01)。中、高剂量组之间无显著差异(P>0.05)；低剂量组血清T与正常组比较无明显变化。

2.2 雄鼠整体检查

与正常组相比，低剂量组睾丸重量增加(P<0.05)；中剂量组睾丸重量无明显变化；高剂量组睾丸重量明显下降，并分别与其它3组比较有显著性差异(P<0.01)。与正常组相比，低剂量组、中剂量组体重有升高的趋势(P=0.07,P=0.22)；高剂量组体重明显降低, 并分别与其它3组比较有显著性差异(P<0.01)。与正常组相比，低剂量组肛门生殖器距离(AGD)有增加趋势(P=0.39)；高剂量组、中剂量组AGD下降(P<0.05，P<0.01)，并与低剂量组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01，表2)。

GroupnTestis weight(g) Anogenital distance(mm) Body weight(g) NC170.199±0.00119.50±0.5838.89±3.82LD150.249±0.060*20.13±0.72△42.25±6.42MD170.224±0.02017.94±3.02*#41.06±3.54HD170.183±0.030**##△△16.05±2.92**##28.0±7.38**##△△

DEHP: Diethylhexylphthalate; NC: Normal control; LD: Low dose; MD: Middle dose; HD: High dose

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsLD group;△P<0.05,△△P<0.01vsMD group

2.3 雄鼠睾丸形态学观察

2.3.1 大鼠睾丸HE染色光镜观察 正常大鼠睾丸曲细精管呈圆形或椭圆形，曲细精管主要由各级生精细胞构成，生精细胞排列规则，曲细精管之间聚集少量Leydig细胞(图1A，图1见彩图页Ⅱ)。低剂量组睾丸Leydig细胞明显增生、聚集成簇，曲细精管扩大，管腔内生精细胞层次增多，次级精母细胞数目增多(图1B)。中、高剂量组Leydig细胞灶区轻度增生，曲细精管扩大、大小不一、形状不规则。高剂量组曲细精管内生精上皮层次减少、细胞稀疏、排列紊乱，生精上皮脱落至管腔内，部分生精上皮出现核固缩(图1C，1D)。

2.3.2 睾丸Leydig细胞电镜观察 正常组大鼠睾丸Leydig细胞(图2A，图2见彩图页Ⅱ)呈多角形或椭圆形，散在分布，位于小血管和成纤维细胞旁，胞质稀疏，核大而圆，胞核明显，呈圆形，染色质位于核膜周边，胞质脂滴较多。与正常组比较，各用药组Leydig细胞(图2B,2C,2D)变为细长梭形，细胞核呈梭形，脂质颗粒少，线粒体、内质网减少。

2.4 睾丸IGF-Ⅰ基因mRNA 表达

与正常组比较，低剂量组睾丸IGF-ⅠmRNA表达升高(P<0.05)；中、高剂量组呈升高趋势(表3)。

Tab. 3 Expression of IGF-Ⅰ mRNA in testis of pup after lactating exposure to ±s)

DEHP: Diethylhexylphthalate; NC: Normal control; LD: Low dose; MD: Middle dose; HD: High dose

*P<0.05vsNC group

2.5 睾丸Leydig细胞StAR蛋白表达

与正常组StAR表达(0.41±0.06)相比，低剂量组StAR表达(0.44±0.09)呈升高趋势；中、高剂量组(0.36±0.04、0.37±0.04)明显降低(P<0.05)，中、高剂量组两组之间无明显差异(图3见彩图页Ⅱ)。

3 讨论

DEHP应用于塑料薄膜，特别是聚氯乙烯(PVC)的生产加工过程中，并且随着经济和社会的快速发展，其使用量逐年增加。有报道显示，接触邻苯二甲酸酯类化合物与男性生殖器官的不良发育有关[3]。动物实验表明，孕鼠染毒DEHP可引起雄性仔鼠尿道下裂，并且尿道下裂的概率、尿道下裂的程度与DEHP的染毒的浓度呈正相关[4]。Wistar母鼠妊娠期与哺乳期通过灌胃染毒DEHP会对雄性仔鼠产生长久的剂量依赖性的影响，包括睾丸重量降低、睾丸体积缩小、精子密度下降、生精细胞高度降低、曲细精管直径减小等[5]。本课题组既往报道，妊娠期子宫内暴露不同剂量的DEHP可致睾酮分泌紊乱并且不同的剂量效应不同[6-8]。

Leydig细胞是男性生殖系统中特有的合成和分泌雄激素的细胞，是男性体内睾酮的主要来源。睾丸内有两代Leydig细胞，依次在胚胎期和青春期发育起来。第一代睾丸Leydig细胞称为胎儿型Leydig细胞(fetal Leydig cell, FLC)，由胚胎干细胞分化而来。第二代睾丸Leydig细胞称为成年型Leydig细胞(adult Leydig cell, ALC)，出生后11天由睾丸Leydig干细胞(stem Leydig cell，SLC)分化成子Leydig细胞(progenitor Leydig cell，PLC)，其数目在仔鼠生后21天达到高峰。哺乳期(仔鼠出生后21 d内)属于Leydig成年干细胞分化阶段，是生殖管道发育和性腺分化的活跃期，人类和啮齿类对激素反应比其它时间更为敏感[9]，而且，从哺乳期开始婴儿将不同程度地使用含有增塑剂的奶瓶、婴儿玩具、洗澡盆、输液等，意味着相对妊娠期，他们将有更多机会接触DEHP，因此，哺乳期DEHP染毒对男性生殖的影响的研究，具有更大的社会意义。

本实验研究发现，哺乳期母鼠染毒高剂量的DEHP不仅可引起雄性仔鼠血清T下降，AGD缩短，还可致体重、睾丸重量下降；中剂量DEHP可引起血清T下降和AGD缩短，但睾丸重量和仔鼠体量无明显变化，与Akingbemi BT[10]等研究结果一致；而低剂量组血清T无明显变化，仔鼠睾丸重量增加，仔鼠体重和AGD有升高趋势。这说明低剂量和中、高剂量染毒哺乳期母鼠对雄性大鼠生殖和发育的影响不同，低剂量DEHP可能促进雄性仔鼠的早熟，而中、高剂量DEHP引起T水平下降，与性功能下降和不育症有关。也提示我们，血清T、AGD相对体重和睾丸重量是评价DEHP的毒性作用更加敏感的指标。本实验中，染毒中、高剂量DEHP引起仔鼠AGD缩短，血清T下降，两者的变化一致。AGD缩短说明DEHP可能有抗雄激素作用或可以影响Leydig细胞的类固醇合成[10]。

本实验观察到低剂量组Leydig细胞明显增生，Leydig细胞呈细长梭形，细胞核也呈梭形，脂质颗粒减少，线粒体、内质网减少；曲细精管内生精细胞层次增多。我们认为本实验观察到的低剂量组Leydig细胞的增生和生精细胞的增生可能是致仔鼠睾丸重量增加的主要原因， 但由于DEHP致Leydig细胞结构受损，所以T并没有相应的增加。中、高剂量组Leydig细胞灶区轻度增生，高剂量组还可见到生精细胞凋亡、坏死和丧失现象，这可能是高剂量组最终导致睾丸萎缩的主要原因之一，而睾丸Leydig细胞的形态学改变引起相应的功能下降，可能是导致血清T减少的直接原因。O’shaug-hressy等[11]在雄激素受体缺失小鼠中观察到FLC功能正常，但ALC分化成熟受到阻碍，该研究结果表明雄激素为ALC前体分化所必需，睾酮合成降低又会反过来阻碍ALC的分化成熟从而使睾酮水平进一步下降，形成一个恶性循环。

胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)是一类具有广泛生物学功能的细胞因子，可促进细胞增殖、分化，抑制凋亡[12]。Leydig细胞表达IGF-Ⅰ 及其受体，Wang等[13]研究证明IGF-Ⅰ 是Leydig细胞前体细胞的促有丝分裂因子，IGF-Ⅰ 可促进Leydig细胞的增殖和分化。本研究发现低剂量组Leydig细胞明显增生， IGF-Ⅰ mRNA表达明显升高，中、高剂量组Leydig细胞轻度增生，IGF-Ⅰ mRNA表达呈升高趋势，IGF-Ⅰ mRNA的表达与Leydig细胞增生呈一致性，说明DEHP可以上调Leydig细胞IGF-Ⅰ 基因mRNA的表达，从而刺激Leydig细胞的增殖和分化。

已知雄性激素在睾丸Leydig细胞内的生物合成都起始于胆固醇到孕烯醇酮的转化，这一反应是由位于线粒体内膜的细胞色素P450支链裂解酶(P450scc)催化的，长期以来，人们认为对P450scc的调控为限速步骤。然而其后的许多实验表明真正的限速步骤是除了P450scc外，还有胆固醇转运到线粒体内膜。StAR在胆固醇从线粒体外膜转运至内膜的跨膜转运中起着重要调节作用。睾丸间质细胞合成T过程中的关键酶表达降低的直接后果必然引起单个细胞合成T的能力明显降低，从而影响T的合成和分泌。以往研究证明，StAR mRNA表达水平的下降与很多睾丸毒物引起血清睾酮合成下降相关[14]。 本实验中哺乳期母鼠染毒DEHP，低剂量组仔鼠Leydig细胞StAR蛋白表达有升高趋势；但中、高剂量组表达明显下降(P<0.05)，提示中、高剂量的DEHP可能通过降低Leydig细胞StAR的蛋白表达，干扰胆固醇的转运，从而使睾酮的合成下降。

综上所述，哺乳期母鼠染毒不同剂量的DEHP对雄性仔鼠的效应不同，低剂量的DEHP可能促进雄性仔鼠早熟；中、高剂量的DEHP可引起雄性仔鼠血清睾酮水平降低，其机制可能与DEHP抑制 子Leydig细胞StAR蛋白的表达以及损伤子Leydig细胞的结构有关。

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The effects of DEHP on morphology and function of progenitor Leydig cell in rat

CHEN Han-bin1, MA Jun1, LI Hui-min1, NIU San-qiang2, CHEN Xian-wu1, CHEN Guo-rong4,CHEN San-mei3, WANG Rong-rong4

(1. Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035; 2. Department of Pathology, the Third Hospital of Datong, Shanxi Province， Datong 037008； 3. Medical College, Shaoxing University, Shaoxing 312000； 4. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325015，China)

Objective: To investigate the effects and mechanisms of diethylhexylphthalate(DEHP) on morphology and function of progenitor Leydig cells (PLC) in rats. Methods: Twenty pregnant SD rats were randomly divided into 4 groups (n=5): normal control group, DEHP low dose group , middle dose group, and high dose group, which were treated from postnatal day (PND) 1 to PND 21 of the pubs with DEHP at the doses of 0, 10, 100, 750 mg/(kg·d) in 0.5 ml of corn oil by gavage respectively. At the end of the treatment, the male pups were killed and blood samples were collected for determination of serum testosterone concentration by chemiluminescence method. The body weight, testis weight and anogenital distance (AGD) were measured. The morphology of PLC was observed by light and transmission electron microscopy. The protein expression of steroidogenic acute regulatory protein(StAR) in PLC was determined by immunohistochemistry. The mRNA expression of insulin-like growth factor-Ⅰ( IGF-Ⅰ)in the testis was assayed by real-time PCR. Results: Compared with normal control group, the serum testosterone and AGD of male pubs from the middle and high dose groups were declined significantly (P<0.01), the testis weight and body weight from high dose group were decreased significantly (P<0.01), while the testis weight increased in the low dose group (P<0.05). Under light microscope, PLC showed hyperplasia and cluster aggregation in the low dose group and focal hyperplasia in the middle and high dose group. The spermatogenic cells in seminiferous tubules showed decrease, apoptosis and unfix in the high dose group. Under transmission electron microscope, the PLC showed decreased lipid droplets, smooth endoplasmic reticulum and mitochondriae in the treated group. The mRNA expression of IGF-Ⅰincreased in the low dose group, and the protein expression of StAR decreased in the middle and high dose group. Conclusion: Lactating exposure to DEHP may interfere with the synthesis of testosterone of PLC in male pubs, the decrease of StAR and the damage of PLC may be involved in it.

diethylhexylphthalate; Leydig cell; testosterone; insulin-like growth factor-Ⅰ； steroidogenic acute regulatory protein； pubs

国家自然科学基金资助项目(30671736)；浙江省自然科学基金资助项目(LY12H26002)；浙江省公益性技术应用研究计划项目(2011C23123)

2014-11-04 【修回日期】2015-02-25

R363

A

1000-6834(2015)02-97-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.001

△【通讯作者】Tel: 0577-55579792, 0575-88345685； E-mail: hulangwang307@163.com, csm498@163.com