海马齿状回的5-HT1A受体在大鼠主动回避学习中的作用*

蒋丰泽， 吕 晶， 王 丹， 姜海英， 李英顺， 金清华

(延边大学医学院生理学与病理生理学教研室， 吉林 延吉 133002)



海马齿状回的5-HT1A受体在大鼠主动回避学习中的作用*

蒋丰泽， 吕 晶， 王 丹， 姜海英， 李英顺， 金清华△

(延边大学医学院生理学与病理生理学教研室， 吉林 延吉 133002)

目的：探讨海马齿状回(DG)的5-HT1A受体在大鼠主动回避学习中的作用。方法：SD雄性大鼠36只，随机分为训练组、阻断剂组和激动剂组及相应的对照组(n=6)。在清醒自由状态下，用脑部微量透析法和高效液相色谱法观察海马DG的5-羟色胺(5-HT)含量在主动回避学习过程中的变化；向海马DG微量注射5-HT1A受体阻断剂WAY-100635或激动剂8-OH-DPAT，观察其对大鼠主动回避学习的影响。结果：①大鼠主动回避学习过程中，DG区细胞外液中的5-HT含量在条件反射建立过程中无显著变化，但实验性消退开始时出现明显升高，达到训练前的(164.90±26.07)%(P<0.05)；②每轮训练前，向DG微量注射WAY-100635对大鼠主动回避学习未产生显著影响；③每轮训练前向DG微量注射5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT，能促进条件反射的建立，并抑制条件反射的消退(均P<0.05)。结论：激活海马DG区的5-HT1A受体可易化主动回避学习并巩固相关记忆。

海马齿状回；5-羟色胺；5-HT1A受体；主动回避学习；大鼠

学习和记忆是脑的高级功能，神经递质和学习记忆之间的关系一直是脑功能研究的热点。5-羟色胺(serotonin, 5-HT)是经典的单胺类神经递质，它在学习和记忆功能的调节中起到重要作用。5-HT受体有多种亚型，其中5-HT1A受体在学习记忆研究中受到广泛关注。海马是哺乳类动物完成学习记忆活动的关键结构，而且也是来自中缝核的5-HT能神经元传入的主要靶点，突触后5-HT1A受体主要存在于海马的CA1和齿状回(dentate gyrus, DG)等区域[1]。海马的不同亚区在学习记忆活动中起着不同的作用，而且其作用机制也各不相同[2]。虽然研究报道CA1区的5-HT1A受体在几种海马依赖性学习记忆中有重要作用[3]，但DG区内5-HT1A受体在大鼠主动回避学习中的作用未见报道。因此，为了研究DG区内5-HT1A受体在大鼠主动回避学习中的作用，本实验利用穿梭箱观察大鼠的主动回避学习，并用脑部微量透析法结合高效液相色谱法，观察此过程中DG内5-HT的含量变化，并向DG区微量注射5-HT1A受体阻断剂(antagonist of 5-HT1Areceptor, WAY-100635)及5-HT1A受体激动剂(agonist of 5-HT1Areceptor, 8-OH-DPAT)，进一步探讨DG区内的5-HT1A受体如何参与大鼠的主动回避学习过程。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

选用雄性SD大鼠36只，体重(200±20)g，由延边大学科研实验动物中心提供。实验共分为三个大组：第一大组分为训练组和对照组(n=6)，训练组每日固定时间进行主动回避训练，对照组放入穿梭箱但不进行训练，首轮训练前及每轮训练后对DG区进行微量透析，测定透析样本中5-HT的含量；第二大组分为WAY-100635组和对照组(n=6)，WAY-100635(sigma，美国)为5-HT1A受体阻断剂，用改良林格尔液(2.3 mmol/L CaCl2，4 mmol/L KCl，147 mmol/L NaCl；pH 6.5)将其配制成3 μg/μl浓度的溶液，每轮主动回避训练前15 min，向大鼠DG区微量注射1 μl WAY-100635溶液，对照组给予等量的改良林格尔液，观察药物对主动回避学习的影响；第三大组分为8-OH-DPAT组及对照组(n=6)，8-OH-DPAT(sigma，美国)为5-HT1A受体激动剂，用改良林格尔液将其配制成3 μg/μl浓度的溶液，每轮主动回避训练前15 min向大鼠DG区微量注射1 μl 8-OH-DPAT溶液，对照组给予等量的改良林格尔液，观察药物对主动回避学习的影响。

1.2 手术过程

大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，固定于脑立体定位仪上，参照Paxinos & Watson图谱，将透析探针外套管(外径0.7 mm，内径0.5 mm)垂直插入高于右侧海马DG区1.5 mm处(前囟后退 3.2 mm；旁开 1.6 mm；深度为 2.5 mm)，用牙托粉固定在颅骨表面。术后第2天，第一大组经外套管将微量透析探针插入海马DG区，探针下端超出外套管1.5 mm，用蜡条固定。探针下端有外径为0.2 mm的乙酸纤维素半透膜(DM-22，Eicom，Japan)，可滤过分子量小于5×104的物质。第二大组和第三大组经外套管往DG插入微量注射针，微量注射针下端为细玻璃管(0.075 mm I.D.，0.150 mm O. D.)，超出外套管下端1.0 mm，用于微量给药。术后第3天开始进行主动回避训练，包括海马DG区的微量透析以及微量注射。

1.3 主动回避条件反射

使用穿梭箱(移数科技有限公司，中国上海)对大鼠进行主动回避条件反射的训练。将大鼠从穿梭箱右侧面壁放入，自由活动适应环境3 min。训练过程为：声音刺激10 s(条件刺激)，足底电刺激15 s(非条件刺激，1 mA)，再间隔30 s，如上重复20次，为完整的一轮训练。每日进行两个训练周期(每日上午及下午于固定时间各进行一轮训练，同一只大鼠两次训练时间间隔6 h)，直至达到条件反射的建立标准；之后开始实验性消退过程，即只给声音刺激而随后的电刺激取消。在条件刺激期间，动物逃至对侧安全区成功躲避电刺激，记为一次主动回避反应，主动回避反应率达到70%以上视为条件反射建立标准。随后进行实验性消退，主动回避反应率降到30%以下视为达到实验性消退的标准。

1.4 微量透析样本的收集及5-HT含量的测定

脑部微量透析实验在大鼠清醒、安静状态下进行。微量透析探针连接微量泵(ESP-64，Eicom公司，日本)，以1.5 μl/min的速度灌流改良林格尔液，稳定30 min后，经样本收集器收集透析样本，每个样本收集10 min，收集量15 μl。第一大组动物均连续收集三个样本，将收集好的样本放入-80℃冰箱，用于日后测定5-HT含量。

5-HT含量应用高效液相色谱柱和电化学检测系统(high-performance liquid chromatography with electrochemical detection，HTEC-300，Eicom，Japan)进行测定[4]。将-80℃冰箱中的样本取出，放入4℃冰箱中融化。将融化后的样本抽取10 μl，应用手动进样器注入到HTEC-300内，以0.23 μl/min速度通过高效液相分离柱(CA-50DS)和电化学检测器，测定各个样本中5-HT的含量。以第一轮训练前三个样本的5-HT含量平均值作为100%，计算出训练过程中的5-HT含量变化百分比。

1.5 组织学鉴定

实验结束且冰冻切片准备工作完成后，动物过量麻醉处死，取出完整的脑组织，用10%甲醛溶液固定1 d，再用30%蔗糖溶液脱水1 d，之后做连续冰冻切片，切片厚度为60 μm。 进行中性红染色，显微镜下鉴定微量透析探针或微量注射针所在的位置是否在DG，定位不准确者不列入统计。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 组织学鉴定

大鼠脑标本与Paxinos & Watson 大鼠脑图谱进行比对，确认微量透析探针或微量注射针的埋入位置(图1)，探针或注射针未进入海马DG区者不计入统计。

Fig. 1 Photomicrograph of a typical placement of microdialysis probe in the hippocampal DG region DG: Dentate gyrus

2.2 海马DG区细胞外液中的5-HT含量在主动回避学习中的变化

第一大组大鼠海马DG区细胞外液中的基础5-HT含量为(6.73±1.82) pg/ml，训练组与对照组之间无显著性差异。训练组大鼠在主动回避学习过程中，其主动回避反应率随训练次数增加而增加，而且在训练第5轮达到条件反射的建立标准，在训练第8轮达到消退标准(图2A)。在主动回避条件反射建立过程中，海马DG区细胞外液中的5-HT含量有所降低，在第3轮训练后达到最低值65.38%±10.99%，但与训练前和对照组相比，无显著性差异(图2B)。在实验性消退过程中，海马DG区5-HT含量明显升高，达到训练前的164.90%±26.07%(与训练前相比P<0.05), 其后逐渐回降(图2B)。未进行主动回避训练的对照组大鼠，海马DG区细胞外液中的5-HT水平在实验期间无显著变化(图2B)。

2.3 海马DG区微量注射5-HT1A受体阻断剂对大鼠主动回避学习的影响

WAY-100635组大鼠在训练第7轮达到主动回避条件反射的建立标准，随后进行实验性消退，在训练第10轮达到消退标准；与之相比，DG区注射改良林格尔液的对照组大鼠在训练第6轮达到条件反射的建立标准，在训练第9轮达到消退标准(图3)。

为了直观地表达向大鼠海马DG区微量给药对主动回避条件反射建立以及消退的影响，将各组大鼠达到主动回避条件反射建立标准所需的训练次数，以及随后达到消退标准所需的训练次数列于表1。WAY-100635组的大鼠, 达到主动回避条件反射建立标准所需的训练次数为(133.3±4.2)次，与对照组(123.3±3.3)次相比无显著性差异；其后，大鼠达到消退标准所需的训练次数，WAY-100635组为(53.3±4.2)次，对照组为(46.7±8.4)次，两组间无显著性差异(表1)。

Fig. 2 Change of 5-HT in hippocampal DG during active avoidance learning (n=6) A: Rate of active avoidance; B: Extracellular concentrations of 5-HT in the DG region; 5-HT: Serotonin; DG: Dentate gyrus*P<0.05vspre-training

Fig. 3 Effects of microinjection of WAY-100635(3 μg/μl) into the DG region on rates of active avoidance during conditioned reflex (n=6)

GroupEstablishmentExtinctionControl(WAY-100635)123.3±3.346.7±8.4WAY-100635133.3±4.253.3±4.2Control(8-OH-DPAT)146.7±6.750.0±6.88-OH-DPAT106.7±13.3*113.3±13.3*

WAY-100635： Antogonist of 5-HT1Areceptor; 8-OH-DPAT: Agonist of 5-HT1Areceptor

*P<0.05vscontrol

2.4 海马DG区微量注射5-HT1A受体激动剂对大鼠主动回避学习的影响

8-OH-DPAT组大鼠在第5轮训练时达到条件反射的建立标准，与对照组(第7轮)相比明显提前；而在实验性消退过程中，8-OH-DPAT组大鼠在训练第11轮达到消退标准，对照组大鼠在训练第10轮达到消退标准，显示8-OH-DPAT组大鼠完成实验性消退过程需要更多的训练周期(图4)。

每天训练前往DG区注射8-OH-DPAT的大鼠，达到主动回避条件反射建立标准所需的训练次数为(106.7±13.3)次，明显少于对照组的(146.7±6.7)次(P<0.05)；8-OH-DPAT组大鼠达到消退标准所需的训练次数为(113.3±13.3)次，与对照组的(50.0±6.8)次相比明显增加 (P<0.05, 图4，表1)。

3 讨论

穿梭箱是观察啮齿类动物学习记忆能力的常用设备，本实验利用穿梭箱，建立大鼠的主动回避条件反射，随后进行实验性消退。在此过程中，以大鼠主动回避反应率为观察指标评价大鼠的主动回避学习记忆能力。海马DG区作为信息进入海马的传入点，在信息的处理和编码，以及学习记忆中起着至关重要的作用[5]。因此，本实验在穿梭箱训练过程中，利用脑部微量透析法、高效液相色谱法、神经药理学等方法探讨海马DG区的5-HT及其5-HT1A受体在主动回避学习记忆中的作用。本实验的结果显示，在主动回避条件反射的消退过程中海马DG内5-HT含量明显增加。有文献表明空间障碍大鼠的中缝核5-HT能神经元明显减少[6]，而和空间记忆密切相关的海马是中缝核5-HT能神经元投射的主要区域之一，且本实验表明激活DG局部5-HT1A受体可促进主动回避学习记忆功能，提示海马DG内的5-HT可能通过激活5-HT1A受体参与大鼠的主动回避学习过程。

在5-HT受体的多种亚型中，5-HT1A受体属于G蛋白偶联受体，在海马CA1区和DG区有较高表达，且在海马的突触可塑性及海马依赖性学习记忆中有重要作用[3]。海马DG区主要由三层细胞构成，即分子层、颗粒层及多形细胞层，研究表明DG区的5-HT1A受体主要分布于颗粒细胞层[1]，而此层存在大量GABA能中间神经元。为了探讨DG区5-HT是否通过激活5-HT1A受体参与主动回避学习过程，本实验在每轮穿梭箱训练前向DG区注射5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT。结果发现，大鼠主动回避条件反射的建立过程明显加快，而消退过程明显延长，提示激活DG区的5-HT1A受体可显著促进主动回避学习记忆。Misane等报道，皮下注射高剂量8-OH-DPAT损害大鼠被动回避的记忆保留[7]，此报道与本实验结果不相符，而这种不同可能是因为8-OH-DPAT的作用亚区不同而引起的。5-HT1A受体在海马CA1区的表达密度最大，而DG的5-HT1A受体密度比CA1低[8]。因此我们推测系统给药时优先激活CA1区的5-HT1A受体，导致海马锥体细胞超极化，进而抑制谷氨酸能神经元的神经传递，表现为被动回避实验时的学习记忆损害。一些电生理研究揭示激活DG区的5-HT1A受体会引起兴奋性作用，即来自中缝核的5-HT能神经元在海马DG区的投射终端主要在GABA能中间神经元上，因此向DG区微量注射8-OH-DPAT降低GABA能系统的抑制作用[9]。可见，海马DG区5-HT1A受体的激活可通过抑制GABA能中间神经元的活动，对主动回避学习记忆起易化作用。

突触效应长时程增强(long-term potentiation, LTP)是学术界公认的、学习记忆形成的神经生理学基础。而文献报道，系统给予WAY-100635时剂量依赖性地衰减由新奇环境诱导的LTP，直接向大鼠海马DG区微量注射WAY-100635可阻断麻醉大鼠的LTP[10]。本实验结果与之不符，即每轮训练前向大鼠DG区微量注射WAY-100635，未对主动回避学习产生明显的影响。本实验结果表明，开始消退时5-HT含量出现显著的增加，这可能是由于消退初期DG区5-HT1A受体的下调所引起的，进而出现阻断剂不能影响主动回避条件反射的现象。另外，海马内除了5-HT1A受体外，还存在5-HT2A, 5-HT2C及 5-HT6受体等，而这些受体也参与学习记忆功能的调节。因此我们推测本实验主动回避反应中增加的5-HT，可能在只阻断5-HT1A受体的情况下，通过其他受体参与主动回避反应的调节，进而导致WAY-100635未对主动回避学习产生显著影响。本实验结果提示，海马DG区的5-HT可通过激活5-HT1A受体促进主动回避学习记忆过程，但激活5-HT1A受体后的下游机制有待进一步研究。

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Effect of 5-HT1Areceptors in the hippocampal DG on active avoidance learning in rats

JIANG Feng-ze, LV Jing, WANG Dan, JIANG Hai-ying, LI Ying-shun, JIN Qing-hua△

(Department of Physiology and Pathophysioligy, Medical College, Yanbian University, Yanji 133002， China)

Objective: To investigate the effects of serotonin (5-HT1A) receptors in the hippocampal dentate gyrus (DG) on active avoidance learning in rats. Methods: Totally 36 SD rats were randomly divided into control group, antagonist group and agonist group(n=12). Active avoidance learning ability of rats was assessed by the shuttle box. The extracellular concentrations of 5-HT in the DG during active avoidance conditioned reflex were measured by microdialysis and high performance liquid chromatography (HPLC) techniques. Then the antagonist (WAY-100635) or agonist (8-OH-DPAT) of the 5-HT1Areceptors were microinjected into the DG region, and the active avoidance learning was measured. Results: ① During the active avoidance learning, the concentration of 5-HT in the hippocampal DG was significantly increased in the extinction but not establishment in the conditioned reflex, which reached 164.90%±26.07% (P<0.05) of basal level. ② The microinjection of WAY-100635 (an antagonist of 5-HT1Areceptor) into the DG did not significantly affect the active avoidance learning. ③ The microinjection of 8-OH-DPAT(an agonist of 5-HT1Areceptor) into the DG significantly facilitated the establishment process and inhibited the extinction process during active avoidance conditioned reflex. Conclusion: The data suggest that activation of 5-HT1Areceptors in hipocampal DG may facilitate active avoidance learning and memory in rats.

hippocampal dentate gyrus; 5-HT; 5-HT1Areceptors; active avoidance learning; rats

国家自然科学基金资助项目(30960394，31160211)

2014-06-26 【修回日期】2014-10-22

Q427

A

1000-6834(2015)01-044-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.014

△【通讯作者】Tel： 0433-2435131； E-mail： yqinghua@ybu.edu.cn