miR-25/TWIST1调控通路在成骨细胞矿化中的作用研究

杨丽，赵新兰，唐卓，陈凯，秦爱平

论著·基础

miR-25/TWIST1调控通路在成骨细胞矿化中的作用研究

杨丽，赵新兰，唐卓，陈凯，秦爱平

目的 探究miR-25在成骨细胞分化过程中的作用及其作用机制。方法 β-甘油磷酸(β-glycerophosphate，β-GP)和抗坏血酸(ascorbic acid)诱导成骨细胞矿化，茜素红(Alizarin Red S)染色实验观察成骨细胞的矿化情况。生物信息学运算预测miR-25的靶基因。实时定量PCR法检测miR-25以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制实验用于研究miR-25在成骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-25与其靶基因之间的结合。结果 miR-25的表达随成骨分化过程而逐渐升高。过表达miR-25通过转录后调控其靶基因TWIST1的表达来促进成骨分化。作为调控成骨细胞分化的的转录因子，扭曲基础螺旋—环—螺旋蛋白1(TWIST1)是miR-25的靶基因。结论 miR-125通过作用于靶基因 TWIST1在成骨细胞的分化中发挥了重要的调控作用，表明调控miR-25的表达,可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。

microRNA; 成骨细胞分化; 转录因子；靶基因

成骨细胞和破骨细胞的活性形成了骨重建和骨吸收，二者间的动态平衡维持了骨量的相对稳定。成骨细胞是由原始成骨细胞分化成熟而来的骨形成细胞。多种骨代谢疾病如骨质疏松症或骨形态、骨结构和骨功能的病理状态与成骨细胞的矿化异常密切相关[1]。成骨细胞的矿化过程牵涉了成骨细胞与其他细胞间的相互作用，而这一相互作用过程是受到多个细胞因子调控的复杂过程[2]。miRNA可与靶mRNAs的3’非翻译区(3’UTRs)或编码区序列(CDS)以不完全互补配对的方式结合后[3]，通过抑制其翻译或促使mRNA分子降解的方式参与调控靶基因的表达[4]。

最近有关miRNAs和骨代谢的研究逐渐被人们所重视。然而miR-25在成骨细胞矿化过程中的作用及其机制尚需进一步研究。本研究分析miR-25在成骨细胞分化中的表达模式并揭示miR-25在β-甘油磷酸钠(β-GP) + 抗坏血酸(ascorbic acid ,AA)诱导的成骨细胞分化过程中的调控作用及其机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)细胞：新生小鼠乳鼠颅骨的成骨细胞。(2)主要仪器：Nikon 300型自动摄像倒置显微镜(日本Nikon公司)，电泳仪、转印仪、紫外交联仪、凝胶成像系统(美国Bio．Rad公司)，流式细胞仪(美国Coulter公司)。(3)主要试剂：无酚红α-MEM培养液、Trizol以及胎牛血清(FBS)(美国Gibico公司)，0．25%胰酶-EDTA、胶原酶(美国Gibico公司)，β-GP(美国Invitrogen公司)，AA(美国Sigma公司)，茜素红染色试剂盒(美国Sigma公司), anti-miR-25(GenePharma Co., Ltd),扭曲基础螺旋—环—螺旋蛋白1(TWIST1) siRNA(OriGene Technologies Inc)。

1.2 方法

1.2.1 原始成骨细胞的培养：遵照南华大学附属湖南省老年医院伦理委员会议程用手术、酶消化法分离新生小鼠乳鼠颅骨的成骨细胞。含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的α-MEM培养液吹打均匀后接种于培养皿中，37°C, 5% CO2培养，每2～3天换液1次，至细胞铺满80%培养皿底时以0.25%胰酶消化传代。 使用诱导培养液(含50 mg/L AA、10 mmol/L β-GP)诱导成骨细胞矿化。茜素红染色法鉴定成骨细胞矿化成熟，并检测TWIST1的mRNA及蛋白表达水平。

在AA和β-GP诱导成骨细胞(OBs)分化的第0天、7天、14天和21天分别用Western Blot法、PCR法检测TWIST1蛋白表达水平和miR-25的表达。

1.2.2 实时定量PCR分析：利用罗氏实时荧光定量PCR仪，方法按参考文献[5]。miR-25和TWIST1分别以 U6和β-actin作为内参，其引物见表1、2。

表1 microRNA实时定量RT-PCR引物序列

表2 mRNA实时定量RT-PCR引物序列

1.2.3 茜素红染色：茜素红染色阳性的矿化结节是成骨细胞分化、矿化和功能的标志。其步骤如下：培养皿用PBS洗2次，70%乙醇固定1 h，PBS洗5遍。调至pH 4.2, 1%茜素红染色30 min，加入50%乙醇去除非特异性着色，空气干燥。随后倒置显微镜下以200倍数观察茜素红染色阳性的矿化结节。茜素红定量的测定参照文献[6]的方法：加入氯化十六烷基置室温下30 min。吸取上清，使用紫外分光光度计，波长540 nm处测样本吸光值A，用氯化十六烷基溶液调零，茜素红量用ng/mg蛋白表示。每个视野计数重复3次，取平均值。

1.2.4 miR-25靶基因预测：应用TargetScan软件预测并使用RNA22-HSA进行验证。

1.2.5 质粒构建与转染：质粒构建方法按参考文献[7]，构建包含所预测miR-25结合位点的WT-pGL3-TWIST1-3′UTR。引物如下，F：5′-GGCTCTAGAGTCACCTCAGCGGCCATTC-3′R：5′-GGCCGGCCCCGACAGCCAGTCAAAGA-3′。MUT-pGL3-TRAF6-3′UTR.突变引物如下，F：5′-GACAGCCTTTCCTACTACCAT-3′R：5′-CTTATTCCGTTCCCTTCG-3′

购买miR-25特异性抑制剂2′-O-甲基反义寡核苷酸(anti-miR-25),脂质体和miR-25抑制剂复合体严格按说明书直接和细胞混合。

1.2.6 荧光素酶报告基因实验：外周血单核细胞与野生型或突变型 pGL3-TWIST1-3′UTR和miR-25或 miR-C共培养48 h。空脂质体作为阴性对照。

双荧光素酶报告基因系统(Promega)和光度计用以荧光信号定量。每个荧光素酶值通过海肾荧光素酶值进行校正。

2 结 果

2.1 miR-25与TWIST1表达水平的变化 TWIST1在成骨细胞矿化的表达随时间呈逐步下降趋势。在矿化的关键时间段14～21 d持续处于较低表达水平。miR-25表达在成骨细胞分化过程中逐渐上升，在第0～21 d随着诱导时间的延续逐渐上升。结果表明miR-25的表达在成骨细胞分化过程中呈现明显上升趋势，而TWIST1在成骨细胞矿化的表达呈逐步下降趋势，提示miR-25可能在成骨细胞分化过程中起到了重要的调控作用，且该作用可能与TWIST1相关。见图1。

2.2 miR-25对β-GP和AA诱导的成骨细胞分化的影响 与转染miR-C的对照组比较，转染pre-miR-25组的茜素红定量升高约2倍 (P<0.05)，表明过表达miR-25促进了OBs的分化成熟。见图2。

注：A.TWIST1的表达呈逐步下降趋势，在矿化的关键时间段14～21 d持续处于较低表达水平。B.miR-25的表达呈逐步上升趋势，在矿化的关键时间段14～21 d持续处于较高表达水平

注：Pre-miR-25与对照质粒(pre-miR-C)分别转染成骨细胞，加入50 mg/l抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠诱导培养14 d后，行茜素红染色。与对照组比较，aP<0.05

2.3 miR-25对TWIST1的作用 利用TargetScan软件预测miR-25的靶基因。在TWIST1的3′UTR区存在miR-25的碱基互补序列(图3A)。 将miR-25表达载体(pre-miR-25)转染至OBs并用β-GP 和AA诱导其分化。结果显示，与对照组相比，转染miR-25表达载体组的miR-25的表达明显升高至2倍。这表明miR-25表达载体构建成功(图3B)。 pre-miR-25转染OBs 48 h后实验结果表明，过表达miR-25降低了TWIST1的蛋白表达水平，而过表达miR-25的表达对成骨细胞分化相关的其他一些关键基因如：SMAD5、EPAH4 没有直接作用，而TWIST1的mRNA水平无明显改变(图3C)。

将WT-pGL3-TWIST1-3’UTR或MUT-pGL3-TWIST1-3′UTR与pre-miR-25或miR-C共转染OBs。结果示，与共转染miR-C或MUT-pGL3-TWIST1-3′UTR相比，当WT-pGL3-TWIST1-3′UTR与miR-25共转染时，miR-25结合于TWIST1 mRNA的3’UTR端致荧光素酶活性受到明显抑制，而对照组荧光素酶活性则无明显改变(图3D)。结果表明miR-25结合于TWIST1的3’UTR，且TWIST1是miR-25的靶基因。

注：A.图示TWIST1的3’UTR端存在miR-25的结合位点，且标注了野生型(WT)TWIST1-3’UTR以及突变型(MUT)TWIST1-3’UTR。B. PCR实验验证miR-25过表达与抑制表达载体构建成功，与对照组比较，aP<0.05。C.miR-25在转录后水平抑制TWIST1的表达。过表达miR-25的表达对成骨细胞分化相关的其他一些关键基因如：SMAD5、EPAH4 没有直接作用。与对照组比较，aP<0.05。D.荧光素酶报告基因实验示：共转染pre-miR-25可以降低野生型(WT)TWIST1-3’UTR的荧光素酶活性而不影响突变型(MUT)TWIST1-3’UTR的荧光素酶活性

图3 miR-25直接作用于其靶基因TWIST1

3 讨 论

在本研究中我们发现，miR-25参与调控了由β-GP和AA诱导的OBs的矿化过程，并且发现了miR-25通过作用于其靶基因 TWIST1发挥其在成骨细胞分化过程中的调控。

miRNAs在转录后水平对基因表达的调控发挥了重要作用。本研究发现OBs的成熟矿化过程中miR-25的表达明显升高。在本研究中，我们选取miR-25作为研究对象并进一步研究其在成骨细胞矿化过程中的作用及其机制。

本研究发现过表达miR-25促进了矿化结节的生成同时抑制了TWIST1的蛋白表达。抑制miR-25则减少了矿化结节的生成同时促进了TWIST1的蛋白表达。表明miR-25在成骨细胞的分化过程中起到了重要的调控作用。我们对miR-25在破骨细胞的分化过程中的调控机制进行了研究。 研究已发现miRNAs通过与靶基因的3’UTR结合来抑制靶基因的转录或降低靶基因mRNA的稳定性。我们利用TargetScan软件预测发现TWIST1是预测的靶基因之一。结果提示miR-25通过与 TWIST1 mRNA的3’UTR结合来调控成骨细胞的分化。 TWIST1 已被发现并证实作用于成骨细胞的矿化过程[8]，并且有文献已证实TWIST1可以与Runt相关基因2(RunX2)直接作用，来调控成骨相关基因的表达。TWIST1和 RunX2之间的直接相互作用抑制了成骨前体细胞活化后所产生的RunX2与DNA的结合作用[9]。TWIST1可能以类似于神经原质蛋白阻断Smad1录复合物与神经胶质分化相关基因的结合的方式影响了骨形态发生蛋白(BMP)在间充质细胞向成骨细胞的分化过程中的作用[10]。另有实验证实在成骨细胞的分化过程中过表达TWIST1可降低骨钙素和骨桥蛋白的表达，而骨钙素和骨桥蛋白是成骨细胞矿化的重要相关基因[11]。

本研究证实miR-25通过作用于靶基因 TWIST1调控成骨细胞分化。荧光素酶报告基因实验显示，过表达miR-25可抑制野生型 TWIST1荧光素酶报告基因活性，而突变型TWIST1荧光素酶报告基因载体可取消该作用。另外，过表达和抑制试验表明miR-25在转录后水平抑制 TWIST1的表达水平。而对其他一些可能对成骨细胞分化其调控作用的基因例如：SMAD7和 EPHA4的表达没有影响。这些结果提示miR-25在转录后水平抑制 TWIST1基因的表达。

本研究数据可以得出miR-25的作用模式。成骨细胞分化信号在原始成骨细胞激活矿化结节形成的通路，miR-25表达的升高抑制了 TWIST1的蛋白表达并维持了成骨细胞矿化过程。因此，一个新的miR-25/ TWIST1调控通路被挖掘出来。

综上所述，本研究证实了miR-25通过一个新发现的miR-25/ TWIST1调控通路参与成骨细胞的矿化调节，为miRNA在成骨细胞分化中的作用提供了新的认识，揭示了miR-25在成骨细胞分化过程中的重要作用并使miR-25表达的调控,可能成为治疗骨代谢疾病的新手段。

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Study on the role of miR-25/TWIST1 regulatory pathway in osteoblast mineralization

YANGLi,ZHAOXinlan,TANGZhuo,CHENKai,QINAiping.DepartmentofEndocrinology,HunanProvinceGeriatricHospital,Changsha410001,China

Correspondingauthor:QINAiping,E-mail:244652700@qq.com

【Abstrast】 Objective To explore the role of miR-25 in the process of osteoblast differentiation and its mechanism.Methods β-glycerophosphate (β glycerophosphate, β-GP) and ascorbic acid (ascorbic acid) induced osteoblast mineralization, Alizarin Red (Alizarin Red S) experiment were performed to observe stained cells into bone mineralization. Bioinformatics computing predicted target genes of miR-25. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of miR-25 and other related genes. Overexpression experiments and inhibitions experiments were used to investigate the relationship between of miR-25 in osteoblast differentiation and its relationship with target gene. Luciferase gene reporter experiments were used to demonstrate miR-25 binding to its target genes.Results The expression of miR-25 increased gradually in the process of osteogenic differentiation. Overexpression of miR-25 promotes osteogenic differentiation through post transcriptional regulate TWIST1 expression of its target genes . As a transcription factor that regulates the differentiation of bone cells ,TWIST1 is a target gene of miR-25.Conclusion miR-25 plays an important role in the differentiation of osteoblasts by acting on target gene TWIST1, which indicates that the expression of miR-25 may be a new therapeutic target for bone metabolism.

microRNA; Osteoblast differentiation; Transcription factor; Target gene

湖南省自然科学基金(No.13JJ4119)，湖南省保健专项资金(No.A2014-02)

410016 长沙，湖南省马王堆医院老年内分泌科

秦爱平，E-mail:244652700@qq.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.11.024

2015-05-16)