解偶联蛋白2在PM2.5所致的氧化应激损伤心肌细胞中的作用机制探讨*

郑贵浪 吴家兴

近年来，环境污染问题备受关注，尤其是大气污染。其中颗粒物是城市大气污染的重要物质，其管径大小不一，危害有别。其中，空气动力学直径<2.5 μm的颗粒物被称为细颗粒物（PM2.5），与人体健康关系最为密切。流行病学调查研究提示，PM2.5对人体的损害很大，尤其是呼吸系统。近年来，其与心血管疾病关系的研究较多。越来越多的学者认为，PM2.5不但可增加冠心病、高血压、糖尿病患者的心血管疾病的发病率和死亡率，亦可增高健康人群心血管疾病的发病率和死亡率，甚至诱发心律失常、心肌缺血乃至心跳聚停等严重情况发生[1-4]。笔者前期研究也发现，PM2.5可以导致H9C2心肌细胞线粒体损伤，从而引起活性氧（Reactive oxygen species， ROS）产生增多，ATP合成不足，线粒体膜电位损害，PM2.5导致的心肌细胞损伤与线粒体氧化应激过强有关[5]。

线粒体是体内ROS产生的主要部位，而解偶联蛋白（Uncoupling proteins，UCPs）是线粒体内膜上能够通过转运H+降低线粒体膜电位蛋白家族，与细胞内的ROS有着密切的关系[6-7]。线粒体膜电位的轻微改变可以影响ROS的含量。因此，UCPs与ROS的产生关系密切。在5种UCPs的同类物中，UCP2分布最广泛。在糖尿病及神经细胞的保护研究中发现，UCP2可以减少ROS的产生从而起到保护作用，其机制与其通过解偶联作用进而降低线粒体的膜电位有关[8-9]。笔者的前期研究也发现，通过RNA干扰沉默UCP2后，细胞内ROS产生明显增高，提示UCP2的保护作用。

氧化应激过度增强是心肌细胞线粒体功能损伤的重要因素。ROS产生过多，保护因素减弱，如还原型谷胱甘肽（GSH）减少，超氧化物歧化酶（SOD）减少，丙二醛（MDA）增多，在心肌细胞损伤中作用甚大。然而UCP2对PM2.5导致的氧化应激中作用如何，及其对GSH、SOD和MDA影响如何，目前研究较少。本研究就在前期研究的基础上，将进一步揭示UCP2在PM2.5致氧化应激损伤心肌过程中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 RNA干扰片段 由上海吉凯基因公司合成2条RNA干扰片段和1条阴性对照RNA干扰片段，进行RNA干扰片段的筛选。转染成功后，进行RTPCR和Western Blot检测UCP2基因在转录水平及蛋白水平表达情况。最后筛选出有效的干扰片段，即：siRNA2序列上游，5′-CCU CAU GAC AGA CGA CCU C dTdT-3′；下游，5′-GAG GUC GUC UGU CAU GAG G dTdT-3′。具体筛选步骤见前期研究（中国医药科学，2015年第3期）。

1.2 PM2.5配制及心肌细胞处理 H9C2细胞株购自中国科学院典型培养物保存委员会细胞库，用10%小牛血清培养液，在37 ℃培养箱静置培养；1~3 d更换一次培养液。当细胞生长至70%左右密度时，将细胞随机分成三组，分别为NC组，PM2.5组及PM2.5+siRNA组，每组3个样本。三组细胞分别给予常规的培养基，50 μg/mL的PM2.5培养基，含PM2.5（50 μg/mL）与siRNA（80 nmol/L）的培养基刺激。48 h后检测相关指标。用PM2.5采样仪采集PM2.5，超声震荡，洗脱颗粒物，冷冻真空干燥成干粉，-20 ℃保存备用。具体实验步骤见前期研究[5]。

1.3 ROS的检测 按照活性氧检测试剂盒进行操作，购自碧云天，货号S0033。简要步骤为：各组细胞经过处理后，按照试剂说明用1∶1000无血清培养液稀释DCFH-DA。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，然后用无血清细胞培养液洗涤细胞三次。用荧光分光光度计检测，激发波长488 nm和发射波长535 nm[10]。

1.4 GSH、总SOD及MDA的检测 GSH比色法测定原理：二硫代二咲-硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物，故可进行比色定量测定。采用谷胱甘肽测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，货号为A006。SOD可清除超氧阴离子，从而抑制甲赞的形成，反应液蓝色越深，说明SOD酶的活性愈低，反之则酶活性愈高。总SOD的检测采用总SOD活性检测试剂盒（NBT法），购自碧云天，产品编号为S0107。过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰，故可用分光光度计对其进行量化。MDA的检测采用丙二醛测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，货号为A003-1。GSH、总SOD及MDA的检测均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（s）表示，方差齐时，采用单因素方差分析进行统计，两组间比较采用LSD法分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞ROS和MDA的比较PM2.5+siRNA组心肌细胞内ROS含量明显高于PM2.5组，PM2.5组的ROS明显高于NC组，三组两两之间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。而MDA在PM2.5+siRNA组最高，PM2.5组其次，NC组最低，三组见两两比较有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 各组心肌细胞ROS和MDA含量比较（s）

表1 各组心肌细胞ROS和MDA含量比较（s）

NC 组 28.8±4.9 39.02±1.55 PM2.5 组 69.2±6.3 68.33±1.96 PM2.5+siRNA组 90.2±6.2 88.44±1.27 F值 86 707 P值 <0.05 <0.05

2.2 各组心肌细胞GSH含量及总SOD活性的比较PM2.5+siRNA组、PM2.5组和NC组三组之间的GSH含量和总SOD活性比较差异均有统计学意义（P<0.05）；两指标均在PM2.5+siRNA组最低，在NC组最高，PM2.5组位于中间，且两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表 2。

表2 各组心肌细胞GSH含量和总SOD活性比较（s）

表2 各组心肌细胞GSH含量和总SOD活性比较（s）

组别 GSH含量（mg/gprot）总SOD活性（U/mgprot）NC组 767.37±11.03 78.67±3.01 PM2.5组 533.05±10.83 50.37±1.98 PM2.5+siRNA组 421.17±16.90 30.09±2.02 F值 535 313 P值 <0.05 <0.05

3 讨论

PM2.5作为大气污染的重要物质，可作为载体吸附有毒重金属、酸性氧化物、有机污染物、细菌和病毒等多种组分，严重危害人体健康。PM2.5可以损害人类的呼吸系统及心血管系统，很多研究均发现其是心血管疾病的促进因素之一[11-12]。深入研究PM2.5导致心肌细胞损伤的机制，为临床治疗PM2.5所致的远期心肌损伤提供基础研究支持，具有重要意义。

解偶联蛋白（UCPs）是线粒体上的质子转运蛋白，属于线粒体阴离子通道家族。UCPs基因有高度的保守性，有6个家族成员，在人仅表达UCP1-5。UCP2蛋白广泛表达于心肌、肝脏、胰腺以及脑组织等，现在多数认为其是保护性因素，特别是对胰岛细胞及神经细胞的保护作用研究较多。笔者前期研究发现，PM2.5可以导致心肌细胞明显损坏，导致肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）升高，损害线粒体的超微结构，导致线粒体肿胀，嵴断裂，从而导致线粒体膜电位的改变[5]。通过RNA干扰技术沉默UCP2基因的表达后，心肌细胞的线粒体产生更多的ROS，并导致ATP含量的显著下降，进一步加重了心肌细胞的损害。这提示，UCP2在PM2.5致线粒体的损伤中起着保护性的作用。

活性氧（ROS）是指具有氧化还原潜能的氧衍生物，包括游离的基团如：超氧阴离子、羟自由基、次氯酸盐、过氧亚硝酸盐和稳定的基团如过氧化氢。各种细胞均能产生ROS，其来源包括NAD（P）H氧化酶、线粒体、黄嗓吟氧化酶和环氧合酶等。生理状态下，线粒体产生少量的ROS，对细胞有利；在某些病理条件下，线粒体产生大量的ROS，导致细胞器、DNA以及膜结构等损坏，甚至导致细胞凋亡、坏死[13]。GSH和SOD是清除机体过多ROS的重要防御系统。超氧化物通常在SOD的作用下，转化为过氧化氢。GSH与过氧化氢结合，后者则转化成水，减弱ROS的损害作用。MDA是脂质过氧化产物，其含量的改变可以间接反映ROS对脂质的损害作用，受到学者的广泛应用。本研究发现，PM2.5可以导致心肌细胞氧化应激增强，ROS产生过多，从而导致脂质过氧化加剧，表现为MDA的含量明显升高；此外ROS的过度增多，消耗了过多的GSH，导致GSH含量明显下降；同时也消耗了大量的SOD，减弱了SOD的活性，导致心肌细胞抗氧化作用体系减弱。这与其他学者的发现是相一致的[14-15]。

通过RNA干扰技术，沉默心肌细胞UCP2的表达，笔者发现，PM2.5导致的心肌细胞氧化应激损伤进一步加剧，表现为：ROS含量进一步堆积，MDA含量进一步升高，从而过度消耗了机体的抗氧化酶，导致GSH含量明显降低以及SOD活性明显下降。而笔者在前期实验发现，PM2.5可以导致线粒体损伤，而沉默UCP2可以加重线粒体损伤[5]。人为地抑制UCP2的保护作用，将导致细胞损伤的进一步加剧。这也间接地证明：UCP2在PM2.5导致的心肌细胞损伤中起着保护性的作用。这可能是UCP2通过调控线粒体膜电位，进而影响氧化应激的机制所介导的。目前，PM2.5对线粒体的影响，国内外也有少量研究[16-18]。然而本实验也存在明显的不足：（1）仅采用基因沉默的方法，没有采用基因过表达方法探讨UCP2对氧化应激的作用；（2）在指标检测方面，没有观察线粒体的形态，检测线粒体的膜电位及线粒体生物修复功能。

综上所述，PM2.5可以导致氧化应激增强进而损害H9C2心肌细胞；RNA干扰UCP2基因的表达后，可导致心肌细胞的氧化应激损伤进一步加重。这提示，UCP2在PM2.5导致的氧化应激损伤过程中可能起着保护性作用。

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