恒河猴骨髓来源未成熟树突状细胞的培养及鉴定

支 良，陈 鹏，李朝战，李昌亮，关 兴，褚 朋，阿永俊*

（1.枣庄市立医院普外科，山东枣庄 277000;2.昆明医科大学第二附属医院肝胆胰一科，云南昆明 650101）

恒河猴骨髓来源未成熟树突状细胞的培养及鉴定

支 良1，2，陈 鹏2，李朝战1，李昌亮1，关 兴1，褚 朋1，阿永俊2*

（1.枣庄市立医院普外科，山东枣庄 277000;2.昆明医科大学第二附属医院肝胆胰一科，云南昆明 650101）

目的 建立一种体外诱导恒河猴骨髓CD34+细胞分化为树突状细胞（DC）的方法，并对其细胞形态及表面标志进行鉴定。方法 用免疫磁珠分选系统（MACS）分选恒河猴骨髓细胞，收集高纯度的CD34+造血干细胞;加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α），诱导其分化为骨髓来源的树突状细胞，并采用电镜观察细胞形态。用树突状细胞表面标志CD1a及成熟树突状细胞（mDC）表面标志CD83流式抗体染色后分析。结果 细胞因子诱导6d后成功培养出表面呈绒毛状和树枝状突起的典型DC样细胞，流式细胞术分析结果显示92.35%的细胞为DC，27.61%的细胞为mDC。结论 用此方法可在体外培养出高纯度且典型的恒河猴骨髓源性未成熟树突状细胞（imDC），为进一步研究其生物学特性及功能奠定了基础。

恒河猴;未成熟树突状细胞;免疫耐受

*通信作者（corresponding author）:997991476～qq.com

树突状细胞（dendritic cells，DCs）是目前体内功能最强大的专职性抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC），根据DC成熟状态的不同分为未成熟DC（immature dendritic cell，imDC）和成熟 DC（mature dendritic cell，mDC），DC诱导机体产生免疫应答或者免疫耐受，取决于其所处的成熟状态［1］。imDC诱导免疫耐受，mDC诱导免疫应答反应［2］。在不使用免疫抑制剂的情况下，imDC能够诱导移植器官产生免疫耐受而长期存活，认为是一种防治移植排斥反应的有效方法［3］。imDC用于诱导器官移植免疫耐受已成为目前研究的热点和重要发展方向。

由于DC在体内散在分布且含量低，在动物和人外周血中低于有核细胞数的0.1%，尚不足白细胞总量的1%，这已成为系统研究DC的生物学功能所面临的主要问题。由于DC主要来源于骨髓的CD34+造血干细胞，故如何在体外诱导CD34+细胞增殖分化为DC，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键，也是研究者目前亟待解决的问题［4］。非人灵长类动物在形态学和生物学性质上是与人类最为接近的实验动物，因此建立以恒河猴为动物模型的DC研究平台具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10周岁中国雄性恒河猴（昆明动物研究所）。

1.2 试剂

猴淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）（天津市灏洋生物制品公司）;RPMI1640培养基（Gibco公司）;GM-CSF（Peprotech 公司）;TNF-α、和 IL-4（R＆D 公司）;免疫磁珠试剂盒包括 I抗（Anti-Human PECD34）、Ⅱ抗（PE selection cocktail）、纳米磁珠、磁极（Stem Cell公司）;FITC抗人 CD83和FITC IgG1 k Isotype Control（BD 公司）;Mouse monoclonal［NA/34］to CD1a（Phycoerythrin）和 Mouse IgG2a-Isotype Control（Abcam公司）。

1.3 磁珠分选CD34+细胞

用免疫磁珠法（magnetic activated cell sorting，MACS）分离恒河猴骨髓CD34+细胞，首先用猴淋巴细胞分离液根据密度梯度离心法，分离骨髓中单个核细胞，并将其转移到新的离心管内备用。再按CD34 MicroBeads humanmonocyte kit操作说明，分离收集CD34+细胞，并取出一部分做流式细胞术鉴定。

1.4 诱导CD34+细胞分化为DC

将分离得到的CD34+细胞使用细胞计数板，按1×106个/1.5 mL种入12孔板中，添加含10%FCS的1640完全培养液和细胞因子GM-CSF和IL-4，其浓度分别为0.1 mg/L和0.05 mg/L，将细胞置于37℃、5%CO2的温箱内培养。换液前于显微镜下观察细胞增殖情况，半量换液1次/2 d，保持细胞因子终浓度一致。在培养的第6天，一部分用于做流式细胞术分析和电镜观察，另一部分加入 TNF-α（0.1 mg/L）、刺激2 d后成熟。

1.5 流式细胞仪检测诱导的细胞

将每孔内的细胞分别转入1.5 mL离心管内，800 r/min离心10 min，弃上清，取10%FCS的1640完全培养基将沉淀悬起并计数，4×104个细胞/300 μL，转入 500 μL 离心管内，分别加入 10 μL 小鼠单克隆［NA/34］to CD1a，或 20 μL 小鼠 IgG2a同型对照，或20 μL FITC 鼠抗人 CD83，或20 μL FITC小鼠IgG1 k同型对照;并充分混匀常温下染色20 min，以利于抗原抗体结合，将染色后的细胞转移于流式细胞术测定管，用流式细胞仪检测分析。

1.6 细胞的电镜观察分析

1.6.1 扫描电镜:分别收集诱导的imDC和mDC，加入3.5%戊二醛固定液，放入4℃冰箱内固定2 h以上。用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗后再次用1%锇酸固定2 h。乙醇脱水后，换醋酸异戊酯15 min。采用冷冻干燥后用真空镀膜仪镀膜。扫描电镜下观察。

1.6.2 透射电镜:分别收集诱导的imDC和mDC，加入2.5%戊二醛固定液，放入4℃冰箱内24 h。将培养瓶内细胞悬液于1 500 r/min离心10 min，弃上清后加入1.0 mL 10%FCS的1640培养基，充分吹打混匀，转入1.5 mL离心管内，1 500 r/min离心10 min。将管内上清全部吸出，加入2.5%戊二醛固定液约400 μL，勿吹散细胞团，放4℃冰箱内固定2 h。使用二甲胂酸钠缓冲液漂洗3～5次。再将样品置于1%四氧化锇溶液中固定2 h;用二甲胂酸钠缓冲液漂洗3～5次，置于缓冲液中过夜。将样品放入丙酮中进行脱水处理后;将样品依次放入环氧树脂与丙酮1∶2、1∶1溶液及纯环氧树脂中进行浸透处理，每次2 h。将样品放入模具，加入环氧树脂，置于温箱，40℃ 12～20 h，60℃ 48～60 h进行包埋处理。取出包埋块，切片处理。将超薄切片进行染色处理后蒸馏水冲洗;完成后静置待切片干燥后透射电镜观察。

2 结果

2.1 MACS磁珠分选得到高纯度的CD34+造血干细胞

样本1磁珠分选前（图1A）后（图1B）细胞的流式细胞术分析显示，分选前 CD34+细胞纯度为12.45%，分选后纯度达到91.59%;样本2分选前（图2A）后（图2 B）细胞的流式细胞术分析显示，分选后CD34+细胞纯度达到85.89%。

2.2 经流式细胞术鉴定得到大量高纯度imDC

图1 磁珠分选前（A）后（B）细胞的流式细胞术分析Fig 1 Flow cytometry analysis of cells before（A）and after（B）magnetic bead separation

图2 磁珠分选前（A）后（B）细胞的流式细胞术分析Fig 2 Flow cytometry analysis of cells before（A）and after（B）magnetic bead separation

2.2.1 流式细胞术鉴定诱导后的细胞为DC:阴性组中阴性细胞的百分含量为22.91%（图3A）;阳性组CD1a+DC的百分含量为92.35%（图3B），CD1a是DC表面特异性标志，其阳性细胞数的百分含量代表恒河猴DC的纯度，即DC的纯度为92.35%。

2.2.2 流式细胞术鉴定mDC:CD83阴性组细胞中百分含量为9.24%（图4 A）;阳性组CD83+DC的百分含量为27.61%（图4 B）;CD83为mDC的表面标志，即大多数DC为imDC。

2.3 电镜观察所见为典型的DC

2.3.1 扫描电镜结果imDC与mDC:imDC表面有皱褶和较少的毛刺状、绒毛状突起（图5A）;mDC表面大量树枝状细长突起（图5B）。

2.3.2 透射电镜下imDC与mDC形态:imDC形态较规则，突起较少，胞质内有许多吞引泡和多泡体（图6A）;而mDC细胞表面有大量微绒毛，细胞排列紧密，细胞核明显，核膜结构清晰，胞质中有大量深色、高电子密度的细胞器，可见少量线粒体（图6B）。

3 讨论

DC是一种具有刺激初次免疫应答功能的专职抗原提呈细胞，是连接固有免疫应答和获得性免疫应答的纽带［5］。imDC具有摄取和处理抗原的能力，存在于机体除脑以外的所有组织。当接触抗原或炎性介质后imDC可发育分化为mDC，迁移至T细胞活化依赖区发挥抗原提呈功能［6］。同时，在诱导免疫耐受调节中也起着重要的生物学作用。目前，体外诱导DC扩增的方法较多，多数方法采用细胞因子联合诱导DC前体细胞扩增。由于DC的前体细胞不同，刺激前体细胞增殖的细胞因子亦不同。故不同来源的前体细胞及不同的细胞因子所培养的DC在功能上有一定的差异。由骨髓来源的CD34+造血干细胞扩增得到的DC比外周血来源CD34+细胞扩增得到的DC成熟的晚［7］，而且刺激T细胞的增殖能力较外周血来源的DC弱。因此本研究用高纯度的恒河猴骨髓CD34+细胞作DC前体细胞，更适合培养imDC。细胞因子在体外扩增DC的过程中发挥重要作用。实验中GM-CSF+IL-4诱导CD34+细胞分化为DC，其中GM-CSF因子最为重要，既能诱导DC前体细胞增殖，又能促进DC分化和延长 DC 寿命［8］。

图3 流式细胞术鉴定诱导的细胞Fig 3 Cultured DCs were identified by flow cytometry

图4 流式细胞术鉴定诱导的细胞Fig 4 Cultured DCs were identified by flow cytometry

图5 扫描电镜观察imDC与mDCFig 5 ImDC and mDC were observed by scanning electron microscopy（×2 500）

图6 透射电镜观察imDC与mDCFig 6 ImDC and mDC were observed by transmission electron microscopy（×1 000）

本实验采用恒河猴骨髓CD34+造血干细胞体外原代培养的方法，培养了大量骨髓源性imDC，为进一步研究其特性和功能提供实验材料，且培养的imDC具有较高的纯度并保持体内DC所具有的生物学特性。这为imDC的体外培养提供了有效的方法，也为在细胞水平研究DC的表型、功能及免疫治疗等提供可靠的体外实验材料，为最终研究恒河猴肝移植免疫耐受又向前迈出了一步。恒河猴是与人类最为接近的实验动物，建立其肝移植免疫耐受的实验平台，为将来在临床上解决同种异体移植排斥反应诱导受者产生针对移植物的免疫耐受［9］，使移植受体能够避免长期服用免疫抑制剂所带来的机会感染和肿瘤的危险，将有非常重要的意义。

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Culture and identification of immature dendritic cells from rhesus monkey myeloid

ZHI Liang1，2，CHEN Peng2，LI Chao-zhan1，LI Chang-liang1，GUAN Xing1，CHU Peng1，A Yong-jun2*

（1.Dept.of General Surgery，Zaozhuang Municipal Hospital，Zaozhuang 277000;2.Dept.of 1st Hepatobiliary Pancreatic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，China）

ObjectiveTo develop a method for culturing dendritic cells（DC）from rhesus monkey bone marrow CD34+cells，and identify the cells by morphological observation and cell surface marker detection.MethodsTo screen rhesus monkey bone marrow cells using a magnetic activated cell sorting（MACS）system then to collect highly purified CD34+hematopoietic stem cells.Recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor（GM-CSF），interleukin-4（IL-4）and tumor necrosis factor-α （TNF-α）were applied to isolate CD34+hematopoietic stem cells to induce bone marrow-derived DCs.Morphological change of cells was observed under an electron microscope，and cell surface molecules were detected using flow cytometry after cells were stained with DC surface marker CD1a and mature DC surface marker CD83.ResultsTypical DCs with surface villous and dendritic protrusions were identified 6 days after cytokine treatment.92.35%of the cultured cells were DC and 27.61%of the cultured cells were mature DCs（mDC）.ConclusionsWe have established a method for culturing highly purified rhesus monkey bone marrowderived immature DCs（imDC），which may function as a technine plateform to support research in future.

rhesus monkey;immature dendritic cells;immune tolerance

Q813.1+1

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.019

1001-6325（2015）09-1243-06

2014-12-14

2015-04-28

国家自然科学基金（30960378，81160069）;内设研究机构云南省卫生厅研究项目（Z011WS0084）