IL-10抑制TGF-β1诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖及表型转化

郝燕捷，陈 莹，薛 林，韩晓宁，丁文惠*

（北京大学第一医院1.心内科;2.风湿免疫科，北京 100034）

IL-10抑制TGF-β1诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖及表型转化

郝燕捷1，2，陈 莹1，薛 林1，韩晓宁1，丁文惠1*

（北京大学第一医院1.心内科;2.风湿免疫科，北京 100034）

目的 研究白细胞介素10（IL-10）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的大鼠心脏成纤维细胞（CFBs）增殖、向肌样成纤维细胞（MyoFbs）转化的影响及其作用通路。方法 原代培养SD乳鼠CFBs，应用第2～4代，分为对照组、IL-10刺激组、TGF-β1刺激组、IL-10与TGF-β1共同刺激组（IL-10预处理后加入TGF-β1）。每个刺激组设3个复孔，所有实验重复3次。四氮唑盐比色法检测细胞增殖，免疫细胞化学染色检测增殖细胞核抗原表达，免疫细胞化学染色及Western blot检测α-平滑肌细胞肌动蛋白（α-SMA）和ERK1/2、P38激酶磷酸化蛋白的表达。结果 与对照组比较，TGF-β1（10 μg/L）能显著刺激 CFBs增殖及表型转化（α-SMA 表达）（P＜0.01），用 IL-10（10、50和100 μg/L）预处理后，TGF-β1诱导的CFBs增殖及α-SMA表达呈剂量依赖性被显著抑制（P＜0.01）。TGF-β1能显著刺激CFBs内ERK1/2和P38磷酸化水平（P＜0.01），而IL-10（100 μg/L）预处理后，TGF-β1诱导的ERK1/2和P38激酶磷酸化被明显抑制（ERK1/2:P＜0.05;P38:P＜0.01）。结论 IL-10可能通过抑制ERK1/2和P38激酶活化抑制了TGF-β1诱导的CFBs增殖及向MyoFbs转化。

白细胞介素-10;心脏成纤维细胞;转化生长因子-β1;细胞外信号调节激酶;P38激酶

在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后的心室重构发展过程中，心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFBs）增殖、向肌样成纤维细胞（myofibroblasts，MyoFbs）转化、分泌大量细胞外基质是重要的病理机制之一。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）能够促进 CFBs 增殖及表型转化，是AMI后左室重构重要促进因子［1］。

白介素10（interleukin-10，IL-10）是一种多功能性免疫调节细胞因子，在抑制纤维化方面也有重要作用，它能拮抗 TGF-β1 促进肝脏纤维化［2］。在AMI患者的血浆及心肌组织中IL-10有高表达，而且能够改善AMI大鼠的左室重构［3］。IL-10能否抑制CFBs的增殖/表型转化及拮抗TGF-β1的作用，目前尚未见报道。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）超家族成员ERK1/2及P38在TGF-β1诱导的CFBs表型转化中发挥了重要作用［4］，IL-10能够抑制 MAPKs通路［5］。本研究观察 IL-10 对 TGF-β1 诱导的大鼠CFBs增殖及向MyoFbs表型转化的影响，及是否通过ERK1/2及P38通路调控。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物选用清洁级SD乳鼠［北京大学第一医院实验动物中心提供，合格证号:SYXK（京）2014-0010］;重组大鼠 IL-10及重组人 TGF-β1（Peprotech公司）;小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体（武汉博士德公司）;小鼠抗人增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体及免疫细胞化学染色试剂盒PV-6001/6002 PowerVisionTM（北京中杉金桥生物技术有限公司）;兔抗大鼠ERK1/2、磷酸化ERK1/2、P38和磷酸化 P38多克隆抗体（Cell Signaling公司）;ERK1/2及 P38的抑制剂 PD98059和SB203580（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代培养SD乳鼠CFBs及鉴定:将乳鼠心室剪碎，0.1%胰蛋白酶消化、离心、收集细胞于DMEM培养液中，差速贴壁法培养30 min，贴壁的主要是心脏成纤维细胞。继续培养至细胞接近汇合时以1∶3传代。实验采用第2～4代。

免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定:Vimentin染色阳性而α-SMA染色阴性证实为成纤维细胞。

1.2.2 IL-10对TGF-β1诱导的CFBs增殖及表型转化的影响:实验分组:1）对照组（control）:培养过程中不加任何刺激剂;2）IL-10刺激组（10、50和100 μg/L3 个亚组）;3）TGF-β1 刺激组:10 μg/L;4）IL-10（10、50 和 100 μg/L）预处理 1 h 后再加TGF-β1（10 μg/L）共同刺激组。48 h 后进行下面实验。

MTT比色法:参照文献［6］进行。

免疫细胞化学染色法测定PCNA及α-SMA表达:按试剂盒说明书操作。在MTT实验结果基础上IL-10选取100 μg/L剂量。染色之后，每张爬片在400倍倒置相差显微镜下拍摄4个无重复视野，用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统计数细胞核呈棕色的PCNA阳性细胞核及所有细胞核，计算增殖指数:增殖指数（proliferation index）（%）=（PCNA阳性染色细胞核数/所有细胞核数）×100%。计数胞质染成黄色的α-SMA阳性细胞数及所有细胞数，计算转化指数:转化指数（transformation index）=（α-SMA阳性染色细胞数/所有细胞数）×100%。

1.2.3 TGF-β1对 ERK1/2、P38 磷酸化的影响:实验分组:1）对照组（control）:即0 min组;2）TGF-β1刺激组:分别刺激 30 min及 1、2、4、8和 24 h。Western blot测定ERK1/2及 P38总蛋白及磷酸化表达，根据文献［5］进行。

1.2.4 应用ERK1/2、P38激酶阻断剂后TGF-β1对成纤维细胞表型转化的影响:实验分组:1）对照组（control）;2）TGF-β1刺激组;3）PD98059（ERK1/2阻断剂）组:50 μmol/L;4）SB203580（P38阻断剂）组:20 μmol/L;5）TGF-β1+PD98059 组:先 用PD98059（50 μmol/L）预处理 1 h 后再与 TGF-β1 共同刺激;6）TGF-β1+SB203580组:先用预处理SB203580（20 μmol/L）1 h 后再与 TGF-β1 共同刺激。刺激24 h后收集细胞蛋白进行实验检测。Western blot测定 α-SMA蛋白表达，结果以相对α-SMA表达（α-SMA/β-actin吸光度比值）表示。

1.2.5 IL-10 对 TGF-β1 活化的 ERK1/2、P38 激酶的影响:实验分组:1）对照组（control）;2）IL-10刺激组:100 μg/L;3）TGF-β1 刺激组;4）IL-10（100 μg/L）预处理1 h后再TGF-β1共同刺激组。Western blot测定ERK1/2及P38蛋白表达。ERK1/2组于TGF-β1刺激4 h后收集蛋白;P38组于进行TGF-β1刺激2 h后收集蛋白进行检测。结果以相对ERK1/2或P38表达（ERK1/2或P38/β-actin吸光度比值）表示。

上述实验n=3，重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.5软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 IL-10抑制TGF-β1诱导的CFBs增殖

2.1.1 MTT结果:TGF-β1组 A值显著增加（P＜0.01），用IL-10与TGF-β1共同刺激后，细胞增殖较单纯 TGF-β1 刺激组下降（10 μg/L 及 50 μg/L 组P＜0.05;100 μg/L组P＜0.01），抑制作用随IL-10浓度增加而有所增强（图1）。在不加用TGF-β1而单独用IL-10刺激的状态下，各个IL-10剂量组细胞增殖较对照组均无明显变化（各组间比较P＞0.05，图2）。

2.1.2 PCNA染色结果:TGF-β1组细胞增殖指数显著增加（P＜ 0.01），IL-10（100μg/L）+TGF-β1组增殖指数显著低于TGF-β1组（P＜0.01）（图3）。

2.2 L-10浓度依赖性地抑制TGF-β1诱导的CFBs表型转化

图1 IL-10对TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞增殖的影响Fig 1 Effect of IL-10 on cardiac fibroblasts proliferationinduced by TGF-β1（±s，n=9/group）

图2 IL-10对基础状态下心脏成纤维细胞增殖的影响Fig 2 Effect of IL-10 on cardiac fibroblasts proliferationunder basal condition（±s，n=9/group）

TGF-β1刺激组较对照组α-SMA表达阳性细胞比率显著增多（P＜0.01）;但IL-10+TGF-β1组较单纯TGF-β1组，α-SMA阳性表达明显减少（10 μg/L组P＜0.05;50 μg/L 及 100 μg/L 组:P＜0.01），且抑制作用随IL-10浓度增加而增强（图4）。

2.3 TGF-β1及 IL-10对 ERK1/2和 P38磷酸化的影响

2.3.1 TGF-β1诱导 ERK1/2及 P38磷酸化:ERK1/2在加入TGF-β1刺激后30 min时即发生明显磷酸化，4 h磷酸化水平最高，维持至8 h，24 h恢复至基础水平;P38于TGF-β1刺激后2 h磷酸化程度最高，随后磷酸化水平逐渐降低，24 h恢复基础水平（图5）。

2.3.2 阻断ERK1/2、P38激酶活性TGF-β1诱导的α-SMA 表达降低:与 TGF-β1 组相比，50 μmol/L PD98059预处理1 h再与TGF-β1共孵育组α-SMA蛋白的表达显著降低（P＜0.05），20 μmol/LSB203580预处理组α-SMA蛋白的表达也显著降低（P＜0.01）（图6）。

图3 IL-10对基础状态及TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞增殖的影响Fig 3 Effects of IL-10 on the PCNA expression of cardiac fibroblasts under basal and TGF-β1-induced conditions

图4 IL-10对基础状态及TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞向肌样成纤维细胞转化的影响Fig 4 Effects of IL-10 on the α-SMA expression of cardiac fibroblasts under basal and TGF-β1 induced conditions measured by immunocytochemical staining（×400）

图5 ERK1/2、P38蛋白在TGF-β1刺激后各时间点磷酸化蛋白表达情况Fig 5 Effects of TGF-β1 on the phosphorylation of ERK1/2 and P38 in cardiac fibroblasts measured by Western blot

图6 ERK1/2及P38抑制剂对TGF-β1诱导的α-SMA蛋白表达的影响Fig 6 Effects of TGF-β1 on the α-SMA expression of cardiac fibroblasts when ERK1/2 and P38 pathway were inhibited

2.3.3 与TGF-β1组相比，IL-10抑制了 TGF-β1诱导的ERK1/2和P38激酶磷酸化 IL-10（100 μg/L）+TGF-β1组ERK1/2及P38磷酸化水平均显著低于 TGF-β1刺激组（ERK1/2:P＜0.05;P38:P＜0.01）（图7）。

图7 IL-10对TGF-β1诱导的ERK1/2及P38磷酸化蛋白表达的影响Fig 7 Effects of IL-10 on the phosphorylation of ERK1/2 and P38 stimulated by TGF-β1 in cardiac fibroblasts

3 讨论

在大鼠 AMI模型上发现，在 AMI后 TGF-β1 mRNA在心肌中的表达显著增加，与其相伴随的是MyoFbs增多及胶原的堆积［7］。本结果显示TGF-β1刺激后CFBs增殖显著增强，同时向MyoFbs转化增多，进一步从细胞水平证实了TGF-β1在AMI后促纤维化的作用机制。

在缺血再灌注心肌组织中IL-10 mRNA及蛋白表达显著升高，IL-10能够改善心肌梗死大鼠的左室重构［3］，能够抑制大鼠梗死后心肌细胞外Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积［8］。但具体机制尚不清楚。本研究证实IL-10对于基础状态下的CFBs无显著影响，但能够抑制TGF-β1促CFBs增殖的作用，且此作用呈浓度依赖趋势。

既往在IL-10与成纤维细胞表型转化方面仅见少数研究报道:IL-10能够抑制人类蜕膜间质细胞（一种类肌样成纤维细胞）α-SMA 的表达［9］;IL-10-/-小鼠损伤愈合明显较正常对照组快，且表达α-SMA的MyoFbs数量明显增多［10］。本实验结果在细胞水平证实了IL-10能够抑制TGF-β1所诱导的CFBs向MyoFbs的转化。

本实验发现在体外IL-10能够抑制TGF-β1诱导的CFBs及向MyoFbs表型转化，这可能是AMI后IL-10抑制心室重构的作用机制之一。

研究显示AMI后ERK1/2和P38通路的活化与心室重构关系密切，而一系列研究证实几种MAPKs（ERK1/2及P38等）都能够被TGF-β1迅速激活［11-12］，本实验证实 TGF-β1 能够促进 ERK1/2及P38的磷酸化，而ERK1/2及P38的抑制剂能够显著减少TGF-β1所诱导的α-SMA表达，更进一步证实了TGF-β1与MAPKs之间的生物联系。IL-10的经典作用信号通路是JAK-STAT通路系统，但有研究发现IL-10改善心肌梗死大鼠左室重构的作用部分是通过抑制P38激酶发挥的［3］，本实验室的前期研究显示IL-10能够通过抑制此通路抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成。本研究结果进一步从细胞水平证实了IL-10能够抑制 TGF-β1诱导的ERK1/2及 P38磷酸化，提示抑制ERK1/2及P38通路可能是IL-10抑制TGF-β1作用的可能机制。

本研究显示IL-10可能是通过抑制ERK1/2和P38激酶活化抑制TGF-β1诱导的CFBs的增殖及表型转化。

［1］van Nieuwenhoven FA，Turner NA.The role of cardiac fibroblasts in the transition from inflammation to fibrosis following myocardial infarction ［J］. Vascul Pharmacol，2013，58:182-188.

［2］Huang YH，Chen YX，Zhang LJ，et al.Hydrodynamicsbased transfection of rat interleukin-10 gene attenuates porcine serum-induced liver fibrosis in rats by inhibiting the activation of hepatic stellate cells ［J］.Int J Mol Med，2014，34:677-686.

［3］Krishnamurthy P，Rajasingh J，Lambers E，et al.IL-10 inhibits inflammation and attenuates left ventricular remodeling after myocardial infarction via activation of STAT3 and suppression of HuR ［J］.Circ Res，2009，104:e9-18.DOI:10.1161/CIRCRESAHA.108.188243.

［4］Liu XY，Sun SQ，Hassid A，et al.cAMP inhibits transforming growth factor-beta-stimulated collagen synthesis via inhibition of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Smad signaling in cardiac fibroblasts［J］.Mol Pharmacol，2006，70:1992-2003.

［5］Dhingra S，Sharma AK，Singla DK，et al.P38 and ERK1/2 MAPKs mediate the interplay of TNF-alpha and IL-10 in regulating oxidative stress and cardiac myocyte apoptosis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293:H3524-3531.

［6］Mosmann T.Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65:55-63.

［7］Sun Y，Zhang JQ，Zhang J，et al.Cardiac remodeling by fibrous tissue after infarction in rats［J］.J Lab Clin Med，2000，135:316-323.

［8］韩晓宁，胡春阳，褚松筠，等.白细胞介素-10抑制大鼠急性心肌梗死后左室心肌胶原沉积［J］.基础医学与临床，2010，30:6-12.

［9］Kimatrai M，Blanco O，Muñoz-Fernández R，et al.Contractile activity of human decidual stromal cells.II.Effect of Interleukin-10［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005，90:6126-6130.

［10］ Eming SA，Werner S，Bugnon PH，et al.Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10［J］.Am J Pathology，2007，170:188-202.

［11］Mulder KM.Role of Ras and Mapks in TGF beta signaling［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2000，11:23-35.

［12］Massagué J，Blain SW，Lo RS.TGF-β signaling in growth control，cancer， and heritable disorders ［J］.Cell，2000，103:295-309.

IL-10 inhibits cardiac fibroblasts proliferation and phenotype transformation induced by TGF-β1 in rats

HAO Yan-jie1，2，CHEN Ying1，XUE Lin1，HAN Xiao-ning1，DING Wen-hui1*
（1.Dept.of Cardiology;2.Dept.of Rheumatology and Clinical Immunology，the First Hospital，Peking University，Beijing 100034，China）

ObjectiveTo examine the effects of IL-10 on cardiac fibroblasts（CFBs）proliferation and phenotype transformation to myofibroblasts（MyoFbs）induced by transforming growth factor-β1（TGF-β1）;and to investigate the regulating pathways.MethodsCardiac fibroblasts were isolated from cardiac ventricles of neonatal SD rats.The passage 2～4 were used and divided into the following groups for treatment:1）control group，2）IL-10 reaction group，3）TGF-β1 reaction group，and 4）IL-10 plus TGF-β1 reaction group（TGF-β1 treatment followed with IL-10 pretreatment）.Cells proliferation was assessed by MTT assay and immunocytochemistry staining for proliferating cell nuclear antigen（PCNA）;the phenotype transformation into MyoFbs was assessed by immunocytochemistry of α-smooth muscle actin（α-SMA）;extracellular signal related kinase（ERK1/2）and P38 kinase pathways were assessed by western-blot.ResultsTGF-β1（10 μg/L）treatment boosted the proliferation and the expression of α-SMA significantly（P＜0.01），while IL-10（10，50 or 100 μg/L）plus TGF-β1 co-treatment induced lower cell proliferation and expression of α-SMA than treating with TGF-β1 alone（P＜ 0.05），with the inhibitory effect of IL-10 being concentration dependent.TGF-β1 could significantly stimulate the ERK1/2 and P38 kinase phosphorylation（P＜0.01），however IL-10（100 μg/L）plus TGF-β1 co-treatment failed to down-regulated the phosphorylation of ERK1/2 and P38 kinase compared with TGF-β1 alone（ERK1/2:P＜0.05;P38:P＜0.01）.ConclusionsIL-10 can attenuate TGF-β1-induced CFBs proliferation and phenotype transformation to MyoFbs.The inhibitory effects may explained by a mechanism of inhibiting the activation of ERK1/2 and P38 kinase.

interleukin-10;cardiac fibroblasts;transforming growth factor-β1;extracellular signal related kinase;P38 kinase

R541.1

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.007

1001-6325（2015）09-1182-06

2015-01-09

2015-04-27

国家自然科学基金（30640083）

*通信作者（corresponding author）:dwh_rd@126.com