局部湿热联合微波消融对乳腺癌荷瘤小鼠CD4+CD25+调节性T淋巴细胞比例和功能的影响

周 涯，李永菊，周洪练，任社华

（遵义医学院1.医学物理学教研室;2.免疫学教研室，贵州遵义 563000）

局部湿热联合微波消融对乳腺癌荷瘤小鼠CD4+CD25+调节性T淋巴细胞比例和功能的影响

周 涯1*，李永菊2，周洪练1，任社华1

（遵义医学院1.医学物理学教研室;2.免疫学教研室，贵州遵义 563000）

目的 探讨局部湿热联合微波消融对乳腺癌荷瘤小鼠脾细胞中CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）比例和功能的影响。方法 小鼠随机分为荷瘤组、局部湿热/微波消融处理组和局部湿热联合微波消融处理组共4组，每组12只。先建立小鼠乳腺癌实验动物模型，分别进行局部湿热、微波消融或局部湿热联合微波消融处理。用FACS检测脾细胞中Tregs的比例变化;real-time PCR检测Foxp3 mRNA水平;FACS检测CTLA-4和GITR的表达;ELISA法检测TGF-β和IL-10的含量;增殖抑制实验观察CD4+CD25－T细胞体外增殖。结果 与单一局部湿热处理组和微波消融处理组相比，Tregs在局部湿热联合微波消融处理组中的比例显著降低（P＜0.05）。并且，Tregs细胞的Foxp3、CTLA-4和GITR的表达也明显降低（P＜0.05），同时TGF-β和IL-10的分泌及抑制功能也显著削弱（P＜0.05）。结论 湿热联合微波消融可以较单一治疗方法更有效的抑制肿瘤生长，这与其降低CD4+CD25+调节性T细胞的比例和功能密切相关。

乳腺癌;微波消融;局部湿热;CD4+CD25+调节性T细胞

CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）是一群特征性表达叉头蛋白-3（forkhead box P3，Foxp3）的CD4+T细胞亚群，组成性表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）和糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体（glucocor-ticoid-induced TNF receptor，GITR），主要发挥免疫抑制功能，在机体免疫自稳中发挥了关键作用［1］。Tregs在抗感染免疫、自身免疫、肿瘤免疫和移植免疫等中均发挥了重要作用［2］。在肿瘤免疫逃逸中，Tregs可通过其膜分子CTLA-4和GITR以及分泌的转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）等抑制机体免疫细胞的功能［3］。因此，Tregs也是近年来临床肿瘤治疗的新靶标之一［4］。

近年来，乳腺癌的发病率逐年增加，严重威胁人类的健康。乳腺癌的免疫逃逸是乳腺癌发生发展的重要原因。当前，热疗已发展为临床乳腺癌的重要治疗策略之一，然而其免疫学机制仍待研究阐明［5］。在前期研究中建立了热疗治疗乳腺癌动物模型的实验技术平台［6］，并观察到局部湿热联合微波消融可有效抑制乳腺癌的体内生长，其机制与血清中IFN-γ的增加密切相关［7］。在本研究中拟进一步观察局部湿热联合微波消融治疗乳腺癌中CD4+CD25+调节性T细胞的比例和功能变化，以期为后续的临床相关治疗策略的优化和推广应用提供重要的前期实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级 Balb/c小鼠（H-2d，4～6周龄，雌性）由重庆医科大学实验动物中心提供［合格证号:SCXK（渝）2007-0001］，饲养于遵义医学院中心实验室SPF级动物室。

1.1.2 细胞系4T1细胞为Balb/c鼠源性乳腺癌细胞系，由贵州遵义医学院免疫学教研室冻存。

1.1.3 主要试剂绿色荧光蛋白（FITC）标记或藻红蛋白（PE）或异位藻蓝蛋白（APC）标记的抗小鼠CD4抗体、抗小鼠CD25、抗小鼠CTLA-4和抗小鼠GITR抗体及同型对照抗体（BD公司）;CD4+CD25+调节性T细胞MACS分析试剂盒（美天妮公司）;鼠TGF-β和IL-10的ELISA检测试剂盒（eBioscinece公司）;MTT试剂盒（Tiangen公司）;其他使用的试剂均为分析纯级。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌小鼠模型的建立及处理:将4T1细胞培养于含100 mL小牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640细胞培养基中，37℃、5%CO2培养，收集对数增殖期的细胞，Balb/c小鼠乳垫处皮下接种（2×105个细胞/只），当肿瘤大于2 mm×2 mm时，判断为模型建立成功。荷瘤小鼠分为未处理组（Cont）、局部湿热处理组（local wet hyperthermia，LWH）、微波消融处理组（microwave ablation，MA）和局部湿热联合微波消融处理组（LWH+MA）共4组，每组12只，具体处理方法同前［7］。

1.2.2 流式细胞技术检测CD4+CD25+调节性T细胞比例及CTLA-4和GITR的表达:常规分离荷瘤小鼠脾细胞，PBS洗涤后以2×106细胞/L重悬，取100 μL细胞悬液，分别加入FITC标记的抗鼠CD4抗体和 PE标记的抗鼠 CD25抗体，4℃共孵育30 min，用PBS洗去游离的抗体，重悬后用流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞比例。根据报道［4］，为了与活化的CD4+T细胞区分，在分析比例和分选时设门选取了CD4+T细胞中CD25high群体。

对于Tregs上CTLA-4和GITR的表达分析，荷瘤小鼠脾细胞分别加入APC标记的抗鼠GITR抗体或抗鼠 CTLA-4抗体，CD4+CD25high设门（gating）后，检测Tregs膜上CTLA-4和GITR的表达，同时加做同型抗体对照。

1.2.3 实时定量PCR分析:常规用FACS分选荷瘤小鼠Tregs细胞。Trizol法提取组织总RNA，按试剂盒试剂说明书指导操作:吸取10 μg mRNA，加入1 μL DNaseⅠ缓冲液和 1 μL DNaseⅠ，用水补足至10 μL 并充分混匀，37 ℃ 作用 30 min，加入 1 μL EDTA，65℃作用10 min后，95℃作用5 min。取5 μL总RNA 进行cDNA 反转录:加入2 μL oligo dT、4 μL 反转录缓冲液、1 μL MML-V 反转录酶、0.19 μL RNase抑制剂和 7.81 μL DEPC 处理水，42℃ 1 h，85℃ 10 min。反应产物于－20℃保存。Real-time PCR按试剂盒说明书操作，对Foxp3的表达进行定量分析。小鼠内参基因GAPDH和Foxp3引物由上海生工公司合成。GAPDH上游引物:5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，下游引物:5'-CA AAGTTGTCATGGATGHACC-3';Foxp3上游引物:5'-ATCTCCTGGATGAGAAAGGCAAGG-5'，下游引物:5'-AGAGCTCTTGTCCATTGAGGCCA3'。反应体系:2 × SYBR（r）Premix Ex TaqTM10 μL，dH2O 8 μL，cDNA 1 μL，PCR 上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，PCR 下游引物（10 μmol/L）0.5 μL。反应步骤:95℃预变性 30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃30 s，45个循环;获取荧光信号温度为84℃，以排除引物二聚体的干扰;55℃至95℃，每升高0.2℃采集1次荧光，绘制熔解曲线以确定扩增产物的特异性。所得数据采用2－ΔΔct法分析。

1.2.4 增殖抑制实验:将MACS分选的CD4+CD25－T淋巴细胞以数量2×105细胞/孔加入96孔板，用2 μg/mL的抗CD3和抗CD28抗体刺激。再按2∶1的靶细胞与效应细胞的比例分别加入各荷瘤组FACS分选的 Tregs（CD4+CD25－T细胞作为靶细胞）。置37℃、5%CO2培养72 h。每组设3复孔。最后用MTT试剂盒检测T细胞的增殖，检测A570值。CD4+CD25－T 细胞增殖抑制率（%）［3］=（对照组A值－试验组A值）/对照组A值。

1.2.5 IL-10和TGF-β分泌水平的检测:常规用FACS分选荷瘤小鼠Tregs细胞。以数量2×105细胞/孔加入96孔板，用2 μg/mL的抗CD3和抗CD28抗体刺激。同时加入50 IU的IL-2。培养72 h后收集上清，按试剂盒说明操作检测上清中TGF-β和IL-10的水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 荷瘤小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的比例变化

与对照荷瘤组相比，各处理组中Tregs的比例均有一定程度降低（P＜0.05）;然而，与单独的湿热处理组和微波处理组相比，湿热处理联合微波消融处理组中 Tregs的比例变化也显著降低（P＜0.05）（图1）。

2.2 荷瘤小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的Foxp3的表达变化

图1 CD4+CD25+调节性T细胞的比例Fig 1 The proportion of CD4+CD25+regulatory T cells

与对照未处理组相比，各处理组中Tregs的Foxp3 mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05）;与单独的湿热处理组和微波处理组相比，湿热联合微波处理组Tregs中Foxp3的mRNA相对表达水平也明显减少（P＜0.05）（图2）。

图2 CD4+CD25+调节性T细胞中Foxp3的相对表达量Fig 2 The relative expression of Foxp3 in CD4+CD25+regulatory T cells（x ± s，n=4）

2.3 荷瘤小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的CTLA-4和GITR表达变化

与对照未处理组相比，各处理组中 Tregs上CTLA-4和GITR的表达水平均明显降低（P＜0.05）;与单独的湿热处理组和微波处理组相比，湿热联合微波处理组中Tregs上CTLA-4和GITR的表达也明显减少（P＜0.05）（图3）。

2.4 荷瘤小鼠CD4+CD25+调节性T细胞分泌IL-10和TGF-β的变化

与对照相比，各处理组中Tregs分泌的TGF-β和IL-10的水平均明显减少（P＜0.05）;与前面膜分子表达结果一致，局部湿热联合微波消融组Tregs分泌TGF-β和IL-10的水平也显著低于单独的湿热处理组和微波处理组（P＜0.05）（图4）。

2.5 荷瘤小鼠CD4+CD25+调节性T细胞体外抑制功能的变化

各处理组中Tregs抑制活性均明显减弱（P＜0.05）;并且湿热处理联合微波处理组中Tregs抑制活性显著低于单独的湿热处理和微波处理组（P＜0.05）（表1）。

3 讨论

目前，热疗已发展成为一种重要的临床乳腺癌治疗策略。由于单一热疗治疗肿瘤的效果仍需进一步提高，因此复合热疗方法近年来也得到了快速发展［5］。然而，热疗治疗肿瘤的作用机制特别是免疫学机制仍待研究阐明［8］。已有的研究显示，CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）在乳腺癌免疫逃逸中发挥了重要作用，并且去除Tregs或抑制其功能可有效增强机体抗肿瘤免疫应答［1，3，8］。本研究结果显示，单一湿热处理、微波消融处理或湿热联合微波治疗均可有效降低荷瘤小鼠脾细胞中Tregs的比例，并且Tregs细胞的Foxp3表达水平也有明显降低，提示Tregs的数量降低是热疗治疗乳腺癌的重要免疫学机制。有意思的是，与单一湿热处理或微波消融处理组相比，湿热联合微波处理组中Tregs的比例变化也非常显著。同时，还观察到Tregs的Foxp3表达水平有显著降低，这提示与单一热疗相比，联合热疗可更有效地降低Tregs的数量和削弱其关键转录因子Foxp3的表达。

图3 CD4+CD25+调节性T细胞上GITR和CTLA-4的表达Fig 3 The expression of CTLA-4 and GITR on CD4+CD25+regulatory T cells

图4 CD4+CD25+调节性T细胞的IL-10和TGF-β的分泌Fig 4 The secretion of IL-10 and TGF-β of CD4+CD25+regulatory T cells（x ± s，n=4）

表1 CD4+CD25+调节性T细胞对CD4+CD25－T细胞体外增殖的抑制率Table 1 The inhibitory ratio of CD4+CD25+regulatory T cells on the proliferation of CD4+CD25－T cells

膜分子CTLA-4和GITR的表达对于Tregs发挥免疫抑制功能具有重要作用［9-10］。为了探讨湿热联合微波处理对Treg抑制功能的影响，检测了荷瘤小鼠中Tregs上CTLA4和GITR的表达变化，发现湿热联合微波处理可以较单一的微波消融和湿热处理方法更显著地削弱Tregs上CTLA4和GITR的表达。此外，还发现Tregs分泌抑制性细胞因子TGF-β和IL-10的水平也显著降低。已有的研究表明，TGF-β和IL-10的分泌对于Tregs的抑制功能也具有重要作用［11-12］。最后，发现Tregs体外抑制功能也显著削弱，这与前期发现湿热联合微波处理后荷瘤小鼠免疫功能增强是一致的［7］。鉴于Foxp3是Tregs抑制功能维持的关键转录因子［13-14］，推测湿热联合微波处理能更有效地削弱Tregs的功能及相关分子表达与Tregs中Foxp3表达降低密切相关。如前所述，在后续研究中，将进一步探讨Tregs功能削弱特别是Foxp3表达降低的分子机制。

总之，通过本研究，发现局部湿热联合微波治疗可以有效降低Tregs的比例并削弱Tregs的抑制功能，这为后续深入探讨联合热疗治疗乳腺癌肿瘤机制和肿瘤热疗策略的临床推广应用及改进提供了重要的前期实验依据。

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The effect of wet hyperthermia combined with microwave ablation on the proportion and function of CD4+CD25+regulatory T cell in animal model of mouse mammary carcinoma

ZHOU Ya1*，LI Yong-ju2，ZHOU Hong-lian1，REN She-hua1
（1.Dept.of Medical Physics;2.Dept.of Immunology，Zunyi Medical College，Zunyi 563000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of wet hyperthermia combined with microwave ablation on the proportion and function of CD4+CD25+regulatory T cell in animal model of mouse mammary carcinoma and explore its significance.MethodsAn experimental model of mouse mammary carcinoma was established and then treated with microwave ablation on day 14.Local wet hyperthermia was also performed.The proportion of CD4+CD25+regulatory T cells（Tregs）in splenocytes was analyzed by FACS.The relative expression of Foxp3，as well as the expression of CTLA-4 and GITR，on Tregs was determined by real-time PCR assay and FACS respectively.Moreover，the secretion of TGF-β and IL-10 from Tregs also were detected by ELISA.In addition，the suppressive capacity of Tregs on CD4+CD25－T cell was also examined by MTT assay.ResultsThe proportion of Tregs in wet hyperthermia combined with microwave ablation treated group decreased significantly compared with that in wet hyperthermia or microwave ablation treated alone group（P＜ 0.05）.Moreover，the expression level of Foxp3 on Tregs decreased significantly（P＜ 0.05）.Furthermore，the expression of CTLA4 and GITR，as well as the secretion of TGF-β and IL-10，on Tregs also obviously decreased（P＜ 0.05）.Finally，the suppressive capacity of Tregs on the proliferation of CD4+CD25－T cells were also significantly impaired（P＜ 0.05）.ConclusionsWet hyperthermia combined with microwave ablation os more effective than single wet hyperthermia or microwave ablation as a mono-therapy alone on the function of Tregs，which may be closely related to the enhanced suppression of tumor growth.

breast cancer;microwave ablation;wet hyperthermia;CD4+CD25+regulatory T cells

R392.11

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.008

1001-6325（2015）09-1188-06

2015-02-01

2015-05-07

国家自然科学基金（31370918）;贵州省科技厅联合基金（黔科合J字LKZ［2013］24号）;贵州省卫生厅项目（D-348）*< class="emphasis_bold">通信作者（corresponding author）:

（corresponding author）:zhouyazmc@163.com