ZNF330促进红系分化

刘晓玲，包韩乌云，赵华路，肖体先，杜鸿琳，王 芳*

（1.中国医学科学院基础医学研究所生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005;2.北京市第五中学，北京 100007;3.北京市第二十中学，北京 100085）

ZNF330促进红系分化

刘晓玲1，包韩乌云1，赵华路1，肖体先2，杜鸿琳3，王 芳1*

（1.中国医学科学院基础医学研究所生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005;2.北京市第五中学，北京 100007;3.北京市第二十中学，北京 100085）

目的 探索ZNF330对红系分化的影响及作用机制。方法 用hemin诱导K562细胞向红系分化，用real-time PCR检测ZNF330的表达;ZNF330的RNAi慢病毒颗粒感染CD34+细胞并向红系诱导后用real-time PCR检测CD235a和γ-globin的表达。在293T/17细胞中，用双荧光报告系统检测ZNF330是否具有转录激活作用;在293T/17细胞中，用Co-IP检测ZNF330与mRNA降解途径中ZNF408的相互作用。结果 在hemin诱导的K562细胞向红系分化过程中ZNF330表达逐渐升高;抑制ZNF330后，CD34+细胞中红系分化标志CD235a和γ-globin的表达下降（P＜0.05）;未检测到ZNF330的转录激活结构域;双向Co-IP证明ZNF330与ZNF408是相互作用蛋白。结论ZNF330促进红系细胞分化，一个可能的机制是通过与一个参与mRNA降解途径的因子ZNF408的相互作用。

ZNF330;CD34+细胞;K562细胞;红系分化;ZNF408

*通信作者（corresponding author）:wo_wfang@hotmail.com

红细胞生成是骨髓多能干细胞定向分化为各个链系的祖细胞并进一步最终分化为红细胞的过程。最终分化为红细胞的数量与生理和发育需求相关，并受到复杂的网络化精密调控。ZNF330作为人的一种自身抗原，在进化过程中高度保守，其N端的NLS信号可能对于ZNF330入核发挥作用很重要［1］。而其所含的9个CXXC基序在哺乳动物的转录因子中很常见，属于锌指蛋白。已经有很多在红系分化中发挥重要作用的锌指蛋白被鉴定出来，如HZF1（ZNF16）促进K562向红系分化［2-3］。但在本研究中发现ZNF330并不是作为转录因子来发挥作用的。

mRNA降解途径是基因表达调控中的一个重要调控步骤。mRNA的半衰期在细胞周期或细胞信号调节时会发生巨大改变，提示mRNA的降解途径是一个可被调控的过程［4］。ZNF330的核定位是RNA依赖性的［5］。ZNF408与mRNA降解途径中的重要蛋白相互作用，本研究证明ZNF330与ZNF408也存在相互作用，因此ZNF330可能是通过与一个参与mRNA降解途径的因子ZNF408的相互作用来促进红系细胞分化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料:胎牛血清、DMEM培养基和IMDM培养基（Gibco公司），RNA提取试剂盒Trizol和反转录试剂盒（Invitrogen公司），实时定量PCR试剂盒（TaKaRa公司），双荧光报告系统检测试剂盒（Promega公司），CD34分选试剂盒（MiltenyiBiotec公司），HA抗体（医科院基础所细胞生物实验室），Flag抗体（F-3165，Sigma公司），Actin（sc-1616，Santa Cruz公司）。

1.1.2 细胞系:人慢性髓系白血病细胞K562（中国医学科学院基础医学研究所细胞中心）。293T/17细胞系（ATCC公司）。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建:ZNF330和ZNF408基因扩增自人cDNA文库。ZNF330分别克隆入pEGFP-C1、连有Flag标签的pcDNA6/V5-HisB载体以及连有GAL4结合蛋白的pM载体。pGL3-promoter载体中插入5×GAL4结合位点。ZNF330的RNAi靶位点为GAGCATCAAGAAGCACTAT，构建入 pWPXL载体中。ZNF408克隆入连有HA标签的pcDNA6/V5-HisB载体中。所有的质粒均经测序验证。

1.2.2 CD34+造血干/祖细胞的分选、感染及培养:慢病毒包装具体方法参照文献［3］。CD34+细胞分选及诱导培养参照文献［6］培养3或5d。

1.2.3 实时定量PCR:按照说明书，用Trizol提取总RNA，并用SuperScript II反转录合成cDNA。用SYBR® Premix Ex TaqTMkit试剂盒完成 Realtime PCR。以β-actin的mRNA水平做为对照。所用引物:CD235a上游引物5'-ACAACTTGCCCATCATTT CTCTG-3'，下游引物 5'-ACAACTTGCCCATCATTTC TCTG-3';γ-globin上游引物5'-GCAGCTTGTCACAG TGCAGTTC-3'，下游引物5'-TGGCAAGAAGGTGCTG ACTTC-3';β-actin上游引物 5'-GCAGCTTGTCACA GTGCAGTTC-3'，下游引物 5'-TGGCAAGAAGGTGCT GACTTC-3'。

1.2.4 双荧光报告系统检测:转染pGL3-promoter-5×GAL4和 pM-ZNF330入293T/17细胞，24 h后收集细胞，用1×PBS漂洗1遍，吸去PBS，尽可能吸净漂洗用PBS。按照双荧光报告系统说明书检测。

1.2.5 免疫共沉淀和Western blot分析:在293T/17细胞中分别转染入ZNF330-Flag和ZNF408-HA、ZNF330-Flag和含HA的pcDNA6/V5-HisB空载体以及ZNF408-HA和含Flag的pcDNA6/V5-HisB空载体这3种组合。参照文献［3］进行Co-IP实验及Western blot分析。

2 结果

2.1 ZNF330促进红系分化

随着K562向红系分化时间的延长，ZNF330的表达呈现缓慢上升趋势（图1A）。通过绿色荧光蛋白和ZNF330的融合蛋白直观检测抑制效果，可见同时转染ZNF330-RNAi质粒的细胞荧光强度明显减少（图1B上），同时转染了ZNF330-RNAi质粒的细胞中ZNF330蛋白量明显降低（图1B下）。在CD34+细胞中，随诱导时间增加，红系分化的标志CD235a和γ-globin的mRNA表达明显升高，而在感染了ZNF330 RNAi慢病毒颗粒的CD34+细胞中，红系分化的标志CD235a和γ-globin的mRNA在诱导第5天时表达与对照细胞相比明显降低（P＜0.05）（图1C）。

图1 ZNF330促进红系分化Fig 1 ZNF330 promotes erythroid differentiation

2.2 ZNF330不具有转录激活作用。

报告基因的荧光素酶活性与ZNF330的表达量无关（图2）。

图2 剂量依赖性检测ZNF330的相对荧光素酶活性Fig 2 The relative luciferase activity was detected by a ZNF330 dose-dependent manner（x ± s，n=6）

2.3 ZNF330和ZNF408相互作用

当ZNF330作为诱饵蛋白，用抗HA抗体可以检测到HA和ZNF408的融合蛋白（图3A）;当ZNF408作为诱饵蛋白，用抗Flag的抗体可以检测到Flag和ZNF330的融合蛋白（图3B）。

图3 Co-IP检测ZNF330和ZNF408的相互作用Fig 3 The interaction between ZNF330 and ZNF408 detected by Co-IP

3 讨论

ZNF330是一个高度保守的自身抗原，虽然较早被发现，然而其功能却一直不明确。在本研究中随着K562向红系分化时间的延长，ZNF330的表达呈现缓慢上升趋势。这可能是由于ZNF330在K562中的基础表达比较高，所以在红系的分化中表达变化不明显。当在CD34+细胞向红系分化的过程中抑制ZNF330时，红系分化受到明显抑制。说明ZNF330促进红系分化。链系定向分化是一个连续的过程，每个链系定向都在众多调节因子作用下完成的。这些因子大部分是锌指蛋白。如C端有一个锌指结构的GATA-1是红系分化和成熟过程中的中心转录因子。然而本实验证明ZNF330虽然有9个保守的CXXC结构，却不能激活报告基因的表达。像ZNF330这样不具有转录活性的锌指蛋白也有报道。如Nsp10，它具有两个锌指结构，却是通过与别的蛋白结合形成复合物以帮助基因组复制［7］。

除了转录调控，转录后调控在基因表达调控中也发挥着重要的作用。其中mRNA的稳定性调控着5%～10%的人类基因。顺式作用元件和序列特异的RNA结合蛋白调控着mRNA降解的速率［8］。mRNA降解调控着正常基因的表达［9］。本研究提出一个新的调控通路即锌指蛋白通过调控mRNA降解途径调控链系分化。酵母的Lsm1-7p复合物定位于细胞质的P小体，后者是mRNA5'→3'降解的激活位点［10］。人的Lsm1-7也定位于细胞质中相当于P小体的位置，故可能与mRNA5'→3'降解相关。Rrp4是外泌小体的RNA结合亚单位。Upf蛋白对于mRNA无义降解很重要［11］。ZNF408和 Lsm2、Rrp4和UPF2（757-1272）相互作用［12］。ZNF330的核定位是 RNA依赖性的，此外红系分化标志CD235a和 γ-globin的表达降低也可能是抑制ZNF330后促进了这些基因的mRNA降解所致，而本实验也证明ZNF330与ZNF408存在相互作用。故ZNF330可能通过参与mRNA的降解途径从而对红系分化起调控作用。

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ZNF330 promotes erythroid differentiation

LIU Xiao-ling1，BAOHAN Wu-yun1，ZHAO Hua-lu1，XIAO Ti-xian2，DU Hong-lin3，WANG Fang1*

（1.Department of Biochemistry and Molecular Biology and State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，
Institute of Basic Medical Sciences，CAMS＆ PUMC，Beijing 100005;2.Beijing No.5 High School，Beijing 100007;3.Beijing No.20 High School，Beijing 100085，China）

ObjectiveTo explore the effects of ZNF330 on erythroid differentiation of K562 cells and underlying mechanism.MethodsRealtime PCR was performed to detect the expression of ZNF330 in K562 cells induced by hemin.After CD34+cells being infected by the recombination lentivirus ZNF330-RNAi，Realtime PCR was applied to detect the expression of CD235a and γ-globin.The luciferase report assay was performed to examine if ZNF330 could act as a trans-acting factor in 293T/17 cells.Co-Immunoprecipitation（Co-IP）was applied in 293T/17 cells to detect the interaction between ZNF330 and ZNF408 which was involved in mRNA degradation.ResultsThe expression of ZNF330 was up-regulated after hemin treatment.The expression of CD235a and γ-globin decreased after inhibition expression of ZNF330 had no effect on report gene.Co-Ip in two ways confirmed the direct binding between ZNF330 and ZNF408.ConclusionsZNF330 can promote erythroid differentiation，and a possible mechanism is that ZNF330 inhibits the function of ZNF408，a factor that is involved in mRNA degradation，through the interaction between the two proteins.

ZNF330;CD34+cells;K562 cells;erythroid differentiation;ZNF408

R34

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.004

1001-6325（2015）09-1167-04

2015-03-04

2015-04-22

国家自然科学基金（30871249）