变波长高效液相法同时测定糕点中的丙酸钙和纳他霉素

刘 莹,王晓蕾，李 伟，张义丞，马雪婷

(1.天津市产品质量监督检测技术研究院 国家加工食品质量监督检验中心,天津 300384；2.北京联合智业检验检测有限公司，北京 100012)

变波长高效液相法同时测定糕点中的丙酸钙和纳他霉素

刘 莹1,王晓蕾1，李 伟1，张义丞1，马雪婷2

(1.天津市产品质量监督检测技术研究院 国家加工食品质量监督检验中心,天津 300384；2.北京联合智业检验检测有限公司，北京 100012)

建立一种同时测定糕点中丙酸钙和纳他霉素的变波长梯度洗脱高效液相色谱检测方法。样品采用超声处理,以甲醇和0.01mol/mL酸性磷酸氢二铵为流动相进行梯度洗脱,经色谱柱为C18(4.6mm×150mm,5μm)分离,程序化变波长检测,外标法定量。该方法可以将丙酸钙和纳他霉素两种防腐剂很好的分离,保留时间分别为(3.5±0.2)min和(9.4±0.2)min,丙酸钙和纳他霉素的线性回归方程相关系数均大于0.9999,方法回收率为89%～98%。采用高效液相色谱同步测定糕点中丙酸钙和纳他霉素的方法具有快速、准确、灵敏度和精密度高的优点,能满足糕点中丙酸钙和纳他霉素含量同步测定的要求。

高效液相色谱法,糕点,丙酸钙,纳他霉素

丙酸钙在酸性条件下产生游离丙酸,具有抗菌作用,对各类霉菌、革兰氏阴性杆菌或好氧芽孢杆菌有较强的抑制作用,还可以抑制黄曲霉素的产生。丙酸是人体代谢过程中的一种产物和反应物,丙酸钙分解后的Ca2+可被吸收[1],所以丙酸钙是一种安全可靠的食品防霉剂。纳他霉素(Natamycin)是纳他尔链霉菌经过发酵得到的一种次级代谢产物,是一种多烯大环内脂类抗真菌剂。由于它能够有效专一的抑制酵母菌和霉菌[2-4],而且具有较好的稳定性,因此是广泛使用的天然生物性食品防腐剂和抗菌添加剂。按照GB2760-2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准[5]中规定,对糕点中添加丙酸钙限量值为2.5g/kg,纳他霉素限量值为0.3g/kg。

由于糕点是高水分含量食品,为了延长糕点的保质期,生产商往往添加复合防腐剂以增强其防腐保鲜效果,导致防腐剂存在多残留和超范围使用现象。因此,建立一种能够同时测定丙酸钙和纳他霉素食品添加剂的方法十分必要。目前,大多数分析方法只能单一测定上述物质,所用的方法有高效液相色谱法[6]、气相色谱法[7-8]、离子色谱法[9-10]。由于两种物质的检测条件不同,能够同时检测的方法研究较少。本实验旨在研究用变波长高效液相色谱法同时测定糕点中丙酸钙和纳他霉素的方法可能性,从而提高检测效率,缩短检测时间。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

夹心蛋糕、月饼 均购于超市;丙酸钙(货号:C16493100)、纳他霉素(货号:C162084000),以上标准品纯度均大于或等于89.5% 均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH;甲醇(色谱纯) 美国TEDIA公司;磷酸、磷酸氢二铵 均为国产分析纯;实验用水 为超纯水。

Aglient 1260高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器) 美国Aglient公司;KQ800DB型数控超生波清洗器800W 昆山市超声仪器有限公司;EASYPUREⅡ型超纯水器 北京普析通用仪器有限责任公司;BSA2245-CW电子分析天平 北京赛多利斯公司;H-2050R 型低速冷冻离心机 北京雷勃尔离心机有限公司;IKA T25型组织捣碎机 上海标本模型厂;pH纸 天津市塘沽区化学试剂厂;0.45μm微孔滤膜 天津市东康科技有限公司。

1.2 高效液相色谱分析条件

色谱柱:Agilent ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm,安捷伦公司);柱温25℃;流速1.0mL/min;流动相A为甲醇,流动相B为0.01mol/mL磷酸氢二铵用磷酸,调整pH4.5～5.5;检测波长程序:0～3.5min,214nm;3.5～12min,305nm;12～14min,214nm;进样量:10μL。按表1进行梯度洗脱。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Elution program of mobile phase

1.3 标准曲线

标准品储备液:准确称取丙酸钙140mg和纳他霉素两种标准品20.0mg,分别用水溶解并定容至100mL。吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置10mL容量瓶中,加稀释溶剂稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品系列溶液,以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘出校准曲线图。

1.4 样品溶液的制备

准确称取5g试样至100mL烧杯中,加水20mL,加入0.01mol/L磷酸溶液0.5mL混匀,经超声浸提15min后,用0.01mol/L磷酸溶液调pH4.5～5.5左右,转移试样至50mL容量瓶中,用水稀释至刻度摇匀。将试样全部转移至50mL具塞塑料离心管中,以不低于4000r/min离心10min,取上清液,经0.45μm微孔滤膜过滤后,待液相色谱测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

实验选取以A液甲醇和B液0.01mol/L磷酸氢二铵溶液,用磷酸调节pH4.5～5.5作为流动相,减少流动相中甲醇的比例或甲醇比例上升较慢时各组分保留时间变长,分离效果较好,但扩散效应大,峰形差。反之,会使出峰时间提前,两种物质的峰分不开,发生重叠[11]。通过改变流动相比例,对丙酸钙和纳他霉素标准溶液进行梯度洗脱,最终确定的最佳流动相梯度如表1所示。用此梯度能使两物质得到完全分离,保证丙酸钙出峰时间3.5min,且缩短纳他霉素出峰时间时间为9.4min,同时峰形较好,减轻或消除峰拖尾现象(见图1),而且保留时间与变波长检测程序的设计相吻合。

图1 丙酸钙、纳他霉素混合标准色谱图Fig.1 HPLC standards chromatograms of calcium propionate and natamycin 注:1:丙酸钙;2:纳他霉素;丙酸钙纳他霉素混合 标准溶液为0.568、0.1mg/mL。

2.2 变波长检测条件的确定

由于不同物质分子结构各异,特征吸收峰的波长各不相同,因此将两种物质标准溶液分别采用DAD进行全波段扫描,以确定其最佳吸收波长。从三维色谱图(见图2)中可见,丙酸钙最大吸收波长在214nm处,纳他霉素最大吸收波长在305nm处。以此作为变波长检测方法的确定依据。丙酸钙的出峰时间为3.5min左右,因此在0～3.5min采用214nm作为其检测波长;纳他霉素的出峰时间为9.4min左右,因此在3.5～12min采用305nm作为其检测波长。

2.3 样品前处理方法的选择

丙酸钙易溶于水,微溶于甲醇、乙醇等有机溶剂;纳他霉素微溶于水和甲醇,难溶于大部分有机溶剂[12]。所以选择纯水作为两种物质提取溶剂,加入适量磷酸溶液,超声浸提。糕点经直接浸提后,杂峰较少,且与丙酸钙和纳他霉素的保留时间不一致,能够有较好的分离,同时有效提取两种物质。

2.4 方法的线性范围和检出限

丙酸钙在35.0～710μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系,纳他霉素在0.1～100μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。两组分的线性方程、相关系数见表2。根据信噪比S/N=3 计算检出限,结果见表2。

2.5 回收率和精密度的测定

称取夹心蛋糕分别添加丙酸钙、纳他霉素标准混合溶液三个水平浓度后进行样品处理,测定回收率和精密度。夹心蛋糕中的丙酸钙不同添加量的回收率在89.2%～96.7%之间,纳他霉素不同添加量的回收率在92.5%～98.9%之间。相对标准偏差在3.88%～6.23%之间。回收率与精密度测定结果分别见表3。由方法回收率与精密度实验结果表明,对于含有微量成分样品的定量测定而言,回收率在80%以上完全能满足定量测定的要求;同时精密度实验的结果表明本研究建立的方法系统误差较小,测定结果比较准确,分析方法可行性高。

表2 糕点中丙酸钙和纳他霉素标准样品的标准曲线方程Table 2 Standard curve equations of calcium propionate and natamycin

图2 丙酸钙、纳他霉素全波长扫描图Fig.2 UV-absorption spectra of calcium propionate and natamycin注:A:丙酸钙;B:纳他霉素。

表3 丙酸钙和纳他霉素回收率和精密度实验结果Table 3 The recovery and precision of calcium propionate and natamycin

2.6 实际样品的测定

随机购买市售的月饼、夹心蛋糕为样本,按照1.4样品前处理的方法,再按照1.2色谱条件进行测定。每种样品平行三次,测定其中的丙酸钙和纳他霉素含量色谱图见图3,结果见表4。该方法对这些样品均具有良好的适用性,色谱无干扰,在所检样品中均未超过国标对食品添加剂的要求。

图3 夹心蛋糕丙酸钙及纳他霉素色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of cake注:1:丙酸钙;2:纳他霉素。

样品丙酸钙纳他霉素月饼214.1260.416216.4110.420209.4650.419夹心蛋糕158.7150.358169.3540.361149.6890.368

3 结论

3.1 在流动相的选择上,采用甲醇溶液(A)和 0.01mol/mL磷酸氢二铵溶液(B)进行梯度洗脱,程序0.0～3.5min,20% A;3.5～5.0min,20%～70% A,5.0～ 12.0min,70% A,12.0～14.0min,70%～20% A。确定了变波长同时检测糕点中丙酸钙和纳他霉素检测条件,其检测波长分别为:214nm(0～3.5min),305nm(3.5～12 min),214nm(12～14min)。

3.2 在供试品溶液的制备中,采用超声波在酸性条件下萃取样品,结果干扰物质较少,同时将两种物质有效提取出来。

3.3 本实验建立的方法操作合理简便,方法精密度高,重复性及线性关系良好,回收率令人满意,对于了解食品中丙酸钙的含量水平以及对纳他霉素的加入量的控制有一定的指导意义。

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Simultaneous determination of calcium propionate and natamycin in cake by high performance liquid chromatography with programmed wavelength UV detection

LIU Ying1,WANG Xiao-lei1,LI Wei1,ZHANG Yi-cheng1,MA Xue-ting2

(1.Tianjin Products Quality Supervision and Inspection Institute,Tianjin 300384,China;2.United Intelligence. Ltd,Beijing 100012,China)

A method of simultaneous determination of calcium propionate and natamycin in cake by high performance liquid chromatography with programmed wavelength UV detection was developed. The samples were extracted with ultrasound pretreatment,separated with Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×150mm)using methanol-di-ammonium hydrogen phosphate(0.01mol/mL)as mobile phase with a gradient elution program,determined with variable wavelength detector,and quantified with external standard curve. This method could achieve the separation of calcium propionate and natamycin in cake,and the retention time of calcium propionate and natamycin was(3.5±0.2)min and(9.4±0.2)min,respectively. The correlation coefficients of calibration curves were all above 0.9999,and average recoveries were 89%～98%.It could conclude that the method that using HPLC to simultaneously determine calcium propionate and natamycin in cake had characters of quickness,accuracy and high-sensitivity,which could meet the requirements of simultaneously determining calcium propionate and natamycin in cake.

HPLC;cake;calcium propionate;natamycin

2014-03-28

刘莹(1982-)，女，硕士研究生，主要从事食品检验研究。

国家重大科学仪器设备开发专项(2013YQ510391);国家自然科学基金项目(31201426)。

TS201.7

A

1002-0306(2015)01-0316-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.058