苹果幼果中酚类物质抗氧化活性研究

陈玮琦,郭玉蓉,张 娟,窦 姣,张晓瑞

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

苹果幼果中酚类物质抗氧化活性研究

陈玮琦,郭玉蓉*,张 娟,窦 姣,张晓瑞

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

苹果幼果,多酚,抗氧化性

苹果为我国产量最大的水果,占全球苹果总产量6000万t的40%,资源十分丰富。而我国目前的苹果加工企业主要集中于苹果浓缩汁等半成品的生产,产品结构单一,附加值低,严重影响着我国苹果加工业的发展[1-2]。因此,充分利用苹果生长周期过程中的各类有效资源,研究开发新的苹果深加工产品已成为当务之急。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果幼果采摘自陕西礼泉。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical 2,2-Diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(1,3,5-tri(2-pyridyl)-2,4,6-triazine,TPTZ)、福林酚 美国Sigma公司;没食子酸 中国药品生物制品检定所;邻二氮菲、邻苯三酚 天津市光复精细化工研究所。所用试剂均为分析纯。

7200可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;Ar2140型电子天平 沈阳龙腾电子有限公司;HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂;旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;KQ-250DB 型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 新鲜苹果幼果,实验前进行打浆处理,现制现用。

1.2.2 没食子酸标准曲线的绘制 采用Folin-ciocalteu法[10]。精确称取没食子酸标准品0.110±0.001g,溶解定容至100mL容量瓶中,备用。吸取上述没食子酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL分别置于50mL容量瓶中,定容至刻度,即得浓度分别为10、20、30、40、50μg/mL的没食子酸工作液。准确吸取1mL上述不同浓度工作液,加入5mL 10%福林酚,充分反应,静置8min后加入4mL 7.5%Na2CO3溶液,混匀后于常温下置于暗处反应2h,以蒸馏水调零,在765nm处测定吸光度。以质量浓度(μg/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制没食子酸标准曲线,其线性回归方程为:y=0.011x+0.1068，R2=0.9996。

1.2.3 苹果幼果多酚的提取及含量测定 准确称取切碎匀浆后的新鲜苹果幼果10.00g,在55℃条件下用100mL 70%乙醇超声波辅助提取30min,过滤,重复提取3次,合并滤液,减压浓缩除去乙醇,并用X-5大孔树脂进行纯化,除去乙醇后真空冷冻干燥得多酚样品。然后按照绘制标准曲线的方法操作,重复测定吸光度3次,带入回归方程,计算苹果幼果中多酚含量。

1.2.4 苹果幼果多酚抗氧化活性的测定

1.2.4.1 FRAP法[11-13]测定苹果幼果多酚总还原力 物质的还原能力与其总抗氧化能力呈显著正相关。苹果幼果多酚总还原力的测定采用Benzie[14]等建立的Ferric Reducing Ability of Plasma(FRAP)法测定其总抗氧化活性大小。Fe3+吡啶三吖嗪可被样品中还原物质还原为二价铁形式,使溶液呈现明显蓝色,于593nm处有最大吸收光,根据吸光度的大小评价样品总抗氧化活性/还原能力的强弱。配制TPTZ工作液参考文献[14]。FeSO4标准曲线绘制:准确量取0.5mL不同浓度的FeSO4溶液,分别加入1.5mL蒸馏水和3mL TPTZ工作液,充分混匀后于37℃反应0.5h,后于593nm处测定吸光度。以FeSO4质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。苹果幼果多酚总抗氧化活性测定:按照绘制FeSO4标准曲线的方法操作,测定吸光度值大小,重复测定3次,根据FeSO4标准曲线和吸光度值,计算FeSO4当量浓度(mg/L)。FRAP值越大,即FeSO4当量浓度越大,苹果幼果多酚抗氧化活性越强。

1.2.4.2 苹果幼果多酚对DPPH·清除作用 DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其甲醇溶液呈紫色,在517nm处有强吸收光。实验采用分光光度法测定加入幼果多酚提取液后样品吸光度值的变化,以此表示其对DPPH·清除能力,结果以对DPPH·清除率表示,清除率越大,则抗氧化性越强[15-16]。操作如下:向装有0.5mL不同浓度梯度的样品甲醇溶液中加入4.5mL DPPH甲醇溶液(0.025mg/mL),摇匀,暗处室温放置30min,于517nm处测定吸光度的变化。每个样品重复3次。清除率按下式计算:

SA(%)=[1-(Ai-Aj)]/A0×100

式中:SA表示对DPPH·的清除率,%;Ai表示幼果多酚和DPPH甲醇溶液混合液的吸光度;Aj表示未加DPPH溶液的幼果多酚溶液的吸光度;A0表示未加样品时DPPH甲醇溶液的吸光度。

具体操作方法:准确量取4.5mL 0.05mol/L,pH8.2的Tris-HCl缓冲液于试管中,于25℃水浴中预热20min,加入供试样品液1mL,2.5mmol/L邻苯三酚0.4mL,充分混匀后在25℃水浴中反应5min,立即用两滴10mol/L HCI终止反应,蒸馏水调零,于325nm处测定吸光度,得A1。空白对照组以0.1mL蒸馏水代替样品,得A0,同时作空白A2,并按下式计算清除率:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

1.2.4.4 苹果幼果多酚对羟基自由基(·OH)的清除作用 采用金鸣[18]等建立的以自由基氧化作用为基础的比色法测定。Fenton反应可使H2O2/Fe2+产生·OH,·OH可使邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+,使其在536mn处的强吸收消失。根据吸光度的减弱判断样品清除·OH的能力。量取5.0mL PBS(0.2mol/L)和5.0mL蒸馏水于试管中,作空白参比;量取5.0mL PBS、1.0mL邻二氮菲、1.0mL FeSO4、2.0mL蒸馏水和1.0mL H2O2(0.01%)于试管中,作损伤;量取5.0mL PBS(0.2mol/L)、1.0mL邻二氮菲(0.75mmol/L)、1.0mL FeSO4(0.75mmol/L)和3.0mL蒸馏水于试管中作未损伤;量取5.0mL PBS、2.0mL样品液和3.0mL蒸馏水于试管中,作样品参比;精密量取5.0mL PBS、1.0mL邻二氮菲、1.0mL FeSO4、2.0mL样品液和1.0mL H2O2(0.01%)于试管中。将上述试管同时置于37℃水浴中反应60min,于536nm处测定吸光值,即得A空白、A未损伤、A损伤、A样参和A样品,每个样品重复测定3次。按下式计算·OH清除率:

·OH清除率(%)=[(A样品-A样参)-(A损伤-A空白)]/(A未损伤-A空参)

苹果幼果多酚抗氧化性实验均选用VC和BHT为阳性对照。

1.3 数据处理和统计方法

实验结果采用“SPSS 13.0”统计软件进行数据分析,Excel软件制表绘图。

2 结果与分析

2.1 苹果幼果中多酚含量的测定

按照1.2.3所述实验方法测定苹果幼果中多酚含量为22.67mg/g。没食子酸标准曲线如图1所示。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 苹果幼果多酚抗氧化活性实验

2.2.1 FRAP法测定苹果幼果多酚总抗氧化能力 采用1.2.4.1的方法进行实验,得FeSO4标准曲线,线性回归方程为:y=3.8165x+0.0254，R2=0.9989,结果如图2。

图2 还原力测定标准曲线Fig.2 Standard curve of reductive power

采用FRAP法测定不同浓度梯度苹果幼果多酚粗提物的总还原能力,结果如图3所示,从图中可以看出:在实验浓度范围内,随着苹果幼果多酚浓度的增加,FeSO4当量浓度也在不断增加,即表明受试物总抗氧化能力不断增强。幼果多酚浓度与总还原能力总体呈正相关。与阳性对照BHT相比,不同浓度苹果幼果多酚提取物FRAP值均比其高,抗氧化能力优于BHT,且均达显著水平(p<0.05),但二者FeSO4当量浓度均低于相应浓度阳性对照VC,且差异显著(p<0.05)。可见,苹果幼果多酚提取物表现出较强的总抗氧化能力。

图3 FRAP法测定不同浓度多酚的还原力Fig.3 Reductive power of polyphenols for different concentrations by the method of FRAP

2.2.2 不同浓度苹果幼果多酚对DPPH·的清除作用 DPPH·分析法被广泛用于清除自由基物质性质的研究,它是一种很稳定的以氮为中心的自由基,实验体系中存在自由基清除剂时,可与DPPH·单电子配对而使其特征吸收峰消失或减弱,表现为吸光度的增大或减小,以此评价受试物的体外自由基清除能力。采用DPPH法测定不同浓度梯度苹果幼果多酚提取物对DPPH·清除作用,结果如图4所示。

由图4可知,幼果多酚提取物,VC,BHT对DPPH·均有较强的清除作用,且随样品浓度的增加而不断增强。当浓度小于30μg/mL时,VC对DPPH·的清除效果优于幼果多酚提取物和BHT,且差异显著(p<0.05)。当浓度大于50μg/mL时,VC和幼果多酚提取物的清除效果相接近,清除效果强。当浓度为90μg/mL时,幼果多酚提取物和VC的清除率分别为96.96%和97.42%,均已接近最大清除率。

图4 不同浓度苹果幼果多酚对DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effects of polyphenols for different concentrations in unripe apple on DPPH·

图5 不同浓度苹果幼果多酚对·的清除作用Fig.5 Scavenging effects of polyphenols for different concentrations in unripe apple on ·

2.2.4 不同浓度苹果幼果多酚对·OH的清除作用 实验采用邻二氮菲-Fe3+-H2O2法评价不同浓度梯度苹果幼果多酚清除·OH的能力,以此反映幼果多酚抗氧化性的强弱。结果如图6所示。

图6 不同浓度苹果幼果多酚对·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effects of polyphenols for different concentrations in unripe apple on ·OH

羟基自由基(·OH)是需氧生物代谢过程中产生的具有强氧化能力的氧自由基,它被认为是毒性最强的活性氧自由基,其反应性极强,寿命极短,对机体的破坏作用最大,是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素。由图5可知,无论是幼果多酚受试物还是阳性对照,三者对·OH均有较强的清除作用,且随浓度的增加,其清除作用增强。当苹果幼果多酚浓度为90μg/mL时,其对·OH的清除率可高达82.20%,当实验浓度大于30μg/mL时,三者对·OH的清除效果强弱顺序为:VC>苹果幼果多酚>BHT,且差异显著(p<0.05)。

2.3 相关性分析

对苹果幼果多酚含量与其抗氧化性作相关性分析,结果如表1所示。

表1 苹果幼果多酚与其抗氧化性的相关系数Table 1 Correlation coefficient between polyphenol contents and antioxidant activity of unripe apple products

注:* 相关性显著(p<0.05),** 相关性极显著(p<0.01)。

3 结论

[1]吕霜竹,霍学喜.中国苹果出口欧盟市场价格竞争力研究[J].华中农业大学学报:社会科学版,2013(4):56-61.

[2]苗洪亮.中国苹果及果汁出口的市场环境分析及对策研究[D].武汉:华中农业大学,2006:1-60.

[3]Lijun Sun,Yurong Guo,Chengcheng Fu,etal. Simultaneous separation and purifycation of total polyphenols,chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples[J]. Food Chemistry,2013,136(2):1022-1029.

[4]唐传核,彭志英. 苹果多酚的开发与应用[J].中国食品添加剂,2001(2):41-44.

[5]Yinrong L,Yeap F L. Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace[J]. Food Chemistry,2000,68(1):81-85.

[6]Suarez B,Alvarez A L,Garcia Y D,etal. Phenolic profiles,antioxidant activity and in vitro antiviral properties of apple pomace[J]. Food Chemistry,2010,120(1):339-342.

[7]Yanggaida A,Kanda T,Tanabe M,etal. Inhibitory effects of apple polyphenols and related compounds on cariogenic factors of mutans streptococci[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(11):5666-5671.

[8]陈莹,徐抗震,聂威,等. 苹果生果中苹果多酚提取工艺的优化研究[J].应用化学,2009,38(11):1582-1585.

[9]艾志录,郭娟,王育红,等. 微波辅助提取苹果渣中苹果多酚的工艺研[J].农业工程学报,2006,22(6):188-191.

[10]高晓明,吕磊,王瑞,等. 苹果多酚的乙醇提取和大孔树脂纯化工艺研究[J].食品研究与开发,2009,30(11):21-25.

[11]牛鹏飞,仇农学,杜寅. 苹果渣中不同极性多酚的分离及体外抗氧化活性研究[J].农业工程学报,2008,24(3):238-242.

[12]李志西,李元瑞,葛蕾,等. 苹果渣多酚超声波提取工艺及其抗氧化性研究[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2005,33(8):131-134.

[13]Spigno G,Tramelli L,Faveri M D D. Effects of extraction time,temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics[J]. Journal of Food Engineering,2007,81:200-208.

[14]Benzie I F F,Strain J J. The ferric reducing ability of plasma as a measure of “antioxidant power”:the FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry,1996,239:70-76.

[15]Akowuah G A,Ismail Z,Norhayati I,etal. The effects of different extraction solvents of varying polarities on polyphenols of Orthosiphon stamineus and evaluation of the free radical-scavenging activity[J]. Food Chemistry,2005,93:311-317.

[16]仇农学,王宏,李艳,等. 苹果渣中多酚物质的体外抗氧化活性[J].浙江林学院学报,2006,23(5):527-531.

[17]吴青,黄娟,罗兰欣,等. 5种中草药提取物抗氧化活性的研究[J].中国食品学报,2006,6(1):284-288.

[18]Larrauri J A,Sanchez-Moreno C,Saura-Calixto F. Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(7):2694-2697.

Antioxidative activitiesinvitroof polyphenols from unripe apple pomace

CHEN Wei-qi,GUO Yu-rong*,ZHANG Juan,DOU Jiao,ZHANG Xiao-rui

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China)

unripe apple;polyphenols;antioxidant properties

2014-03-26

陈玮琦(1989-)，女，硕士研究生，主要从事食品功能成分开发及利用方面的研究。

*通讯作者:郭玉蓉(1962-)，女，博士，教授，主要从事食品生物加工研究。

农业部现代苹果产业技术体系建设专项基金资助(CARS-28)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)01-0115-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.016