多虑平联合促红素治疗慢性病贫血的临床研究

苏婷婷，何云绮

（新乡市第一人民医院血液内科，河南新乡453000；1遵义市第一人民医院，贵州遵义563000）

多虑平联合促红素治疗慢性病贫血的临床研究

苏婷婷，何云绮1

（新乡市第一人民医院血液内科，河南新乡453000；1遵义市第一人民医院，贵州遵义563000）

目的：通过对慢性病贫血(ACD)血清中Hepcidin、IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α表达水平变化分析，初步探索多虑平改善贫血的可能作用机制。方法：将60例ACD随机分为4组。对照组(C)：仅治疗ACD的基础病。单纯多虑平治疗组(SD)：多虑平75 mg/d，口服。单纯EPO治疗组(SE)：EPO 150 U/kg，皮下注射，每周三次。多虑平联合EPO治疗组(DE)：EPO150 U/kg，皮下注射，每周三次；加多虑平75 mg/d，口服。用自动化血液分析仪检测血常规，Elisa法检测上述因子的血清含量。结果：与C组相比，SD组、SE组、DE组血清中的检测因子水平均显著下降(P＜0.05)；与SE组相比，SD组血清中的检测因子水平改变不明显(P＞0.05)；而DE组却明显下降且Hb明显上升(P＜0.05)。与SD组相比，DE的血清检测因子水平明显下降且Hb明显上升(P＜0.05)。结论：多虑平可降低ACD患者血清中检测因子的水平；多虑平与EPO二者联合治疗ACD的效果，明显优于两药物的单独使用。

慢性病贫血；促红素；多虑平；铁调素

慢性病贫血(ACD)是一种发病率仅次于缺铁性贫血的第二大贫血性疾病。常因慢性炎症、慢性感染、肿瘤、创伤及外科手术而产生，故又称炎症性贫血。上述因素会诱导IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子的释放，促进ACD的发生、发展[1]。Hepcidin是一种主要由肝脏产生的在感染、炎症和损伤的刺激下可以强烈表达的具有25个氨基酸的抗菌多肽[2]。它可以影响铁的代谢而促进ACD的发生[3-5]。本研究基于应用组胺拮抗剂，可显著降低IL-6的血清水平，进而下调Hepcidin表达的这一原理，以期实现对ACD的治疗。因此，采用多虑平为主要研究对象，以多虑平、EPO及多虑平联合EPO作为治疗组，通过治疗前后的纵向对比及各治疗组之间差异的横向对比，为ACD的靶向治疗提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集与整理

本实验按ACD诊断标准（参照张之南《血液病诊断及疗效标准》第2版）筛选遵义市第一人民医院2011年3月至2012年9月住院ACD患者60例。其中，男12例，女48例，年龄56岁～71岁。肿瘤相关性贫血20例，恶性血液病12例，炎症性贫血20例，免疫相关疾病8例。所有患者此前均未经输血或铁剂治疗，空腹抽取静脉血，分离出血清，-80℃保存待测。

1.2 主要实验试剂及药物

Hepcidin、IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α等Elisa试剂盒各一个，均购自美国ASSAY公司。多虑平购自南京白敬宇制药。雪达升（rhEPO）购自哈药集团生物工程有限公司。

2 实验方法

2.1 分组及处理

按照ACD基础病的不同，将60例ACD患者分为四组：对照组(C)：仅治疗基础病；单纯多虑平治疗组(SD)：给予多虑平75 mg/d，口服；单纯EPO治疗组(SE)：给予EPO 150 U/kg，皮下注射，每周三次；多虑平联合EPO治疗组(DE)：EPO 150 U/kg，皮下注射，每周三次；加多虑平75 mg/d，口服。

2.2 标本处理及保存

①清晨抽取空腹静脉血，选取肘窝静脉为抽血部位，准确采取静脉血4 mL左右，立即混匀（轻轻翻转5～10次），再次核对标本编号，4 h内以2 500转/分的转速离心20 min左右，仔细收集上清，存于-80℃低温冰箱；②同期采血检测血常规及其他相关检查项目。

2.3 实验方法

①准备标本、试剂：将实验备用标本（经检测不含有NaN3样品）从-80℃超低温冰箱取出,置于室温下使标本解冻，将试剂盒从2～8℃冰箱中取出，平衡至室温30min后开启使用；②标准品的稀释：将原倍标准品(Standard)按照使用说明加入标准品稀释液(Standard Diluent)，分别稀释成800 ng/mL、400 ng/ mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL，并对应标记为5、4、3、2、1号标准品；③加样：标准品孔加入标准品50 μl、链霉素-HRP 50 μL；待测样品孔加入：样本40 μl、抗-HEPCIDIN抗体10 μL、链霉素-HRP50 uL；盖上封板膜，轻轻震荡，使之混匀，在37℃的恒温环境中1 h；④配液：用蒸馏水将30倍的浓缩洗涤液稀释30倍后备用；⑤洗涤：轻轻将封板膜揭去，倾去液体并甩干，将洗涤液滴加于各孔之中，静置30 s后弃去，本步骤需重复5次；⑥显色：每孔依次加入显色剂A与显色剂B各50 μL，注意A与B顺序不能改变，小心震荡使之混匀，37℃环境下，避光显色10 min；⑦终止：每孔滴加50 μL终止液，终止反应，其标志为蓝色转为黄色；⑧测定：将空白孔调零，在450 nm波长下依次测量各孔的吸光度（OD值），该步骤须在加入终止液10 min内进行；⑨计算：以OD值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线，使用curve expert 1.3软件对所得结果进行分析，计算其直线回归方程，再根据样本的OD值计算出其浓度。

3 统计学处理

应用SPSS 13.0软件系统进行统计学分析，计量资料采用x±s进行描述，采用方差分析、LSD-t检验、配对样本的t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

4 结果

4.1 治疗前各分组资料对比

表1 各组基线资料对比

表2 治疗前红细胞相关参数（±s）

表2 治疗前红细胞相关参数（±s）

G C S D SE DE F P n 15 15 15 15 Hb(g/L) 64.01±10.64 64.36±11.68 65.58±7.62 63.31±8.31 0.143 0.934 RBC(×1012/L) 2.85±0.20 2.74±0.33 2.93±0.33 2.76±0.52 0.886 0.454 HCT(%) 31.72±3.27 33.20±2.40 33.58±1.53 29.93±2.14 1.689 0.180 MCV(fl) 80.44±3.92 82.13±1.75 81.47±2.48 82.90±2.07 2.261 0.091 MCH(pg) 33.27±4.59 34.39±2.02 32.35±2.47 34.07±1.71 1.466 0.234

表3 治疗前Hepcidin与细胞因子（±s）

表3 治疗前Hepcidin与细胞因子（±s）

G C S D SE DE F P n 15 15 15 15 Hep(ug/L) 52.51±17.96 54.77±10.41 56.77±11.86 55.28±9.64 0.282 0.838 IL-1(ng/L) 36.65±1.74 36.36±1.11 37.28±0.94 36.79±0.78 1.550 0.212 IL-6(ng/L) 43.67±19.66 40.90±12.08 43.47±10.01 41.60±9.61 0.156 0.925 IL-10(ng/L) 35.61±2.88 37.93±4.01 35.62±6.59 35.00±4.92 1.086 0.363 TNF-α(ug/L) 25.84±5.05 28.46±3.39 27.81±3.19 28.18±3.69 1.387 0.256

表1～3说明，各组资料的性别、年龄无明显差异，且在治疗前各检测指标之间的差异无统计学意义，即各组资料具有同质性。

4.2 各组治疗前后结果对比

结合本实验自身研究，为进一步说明各组治疗结果前后的差异，特进行配对样本t检验，其结果如表4～5。

表4 各组治疗前后红细胞相关参数配对t检验结果

表5 各组治疗前后Hepcidin、细胞因子配对t检验结果

由表4～5可知，C组治疗前后的各项检测指标无明显变化，即仅针对基础病的治疗，不能改善贫血症状；而SD与SE组治疗前后各检测指标均具有明显变化，即多虑平与EPO一样，均可用于贫血的治疗。DE组治疗前后各检测指标也具有明显变化，说明二者存在协同效应。

4.3 治疗后红细胞相关参数、Hepcidin及细胞因子检查结果

按照实验已设定各组治疗方案进行治疗，治疗1月后，再次抽取静脉血进行红细胞相关参数检测及Hepcidin、细胞因子的ELISA法测定，结果如表6，7。

表6 治疗后红细胞相关参数（x±s）

由上表得知，与C相比，SD、SE、DE的Hb、RBC、HCT均明显上升，(P＜0.05)；但所有治疗组中MCV及MCH变化不明显(P＞0.05)。与SE相比，SD的Hb、RBC、HCT、MCV、MCH变化不明显(P＞0.05)。与DE相比，SD、SE的Hb、RBC、HCT变化明显(P＜0.05)；而MCV、MCH变化不明显(P＞0.05)。

表7 治疗后Hepcidin与细胞因子（x±s）

由上表得知，①与C相比，单纯多虑平组SD、SE、DE的Hepcidin及细胞因子的血清含量均明显下降(P＜0.05)；②与SE相比，SD的Hepcidin及细胞因子的血清含量变化不明显(P＞0.05)；③与DE相比，SD、SE的Hepcidin及细胞因子的血清含量变化明显(P＜0.05)。

5 讨论

慢性病贫血(anemia of chronic disease,ACD)是临床上常见的贫血类型[6-7]，多由正细胞正色素贫血过渡为小细胞低色素贫血，以血清铁、总铁结合力及骨髓铁粒幼细胞降低,而血清铁蛋白及单核-巨噬细胞储存铁增加为其临床特点[8]。

Hepcidin是一种在肝细胞合成的具有抗微生物活性的多肽，可以调节铁的吸收、利用和贮存之间的平衡[9-10]。通过抑制MMS释放铁及肠道铁的吸收，在ACD的发病过程中起着关键作用。

IL-1、IL-6等细胞因子，在细菌内毒素及单核-巨噬细胞激活诱导下可以大量产生。其中，IL-6既可以增加铁蛋白(ferritin,Fn)的H链和L链的表达，又可以通过IL-6/STAT3途径调节hepcidin大量表达，进而导致贫血的产生。IL-1可以刺激中性粒细胞释放乳铁蛋白增加，后者既可以与转铁蛋白竞争与铁的结合，也可以调节巨噬细胞铁代谢异常，最终导致低铁血症。IL-10是一种炎症抑制因子，可以抑制多种致炎性细胞因子的分泌[11]，既可刺激Hepcidin的肝脏表达，抑制肠细胞铁吸收和单核-巨噬细胞系统储铁释放，又可上调转铁蛋白受体表达，增加转铁蛋白受体调控的转铁蛋白结合铁向单核细胞的转运[12]。

TNF-α既可抑制EPO的产生，使骨髓对EPO的反应降低，也可抑制红系集落形成单位(burstforming unit-erythroid,CFU-E)。此外，TNF-α还可引起转铁蛋白减少，导致贫血[13]。

多虑平属于三环类抗抑郁药物，既往临床上主要用于治疗各种忧郁症，近年也被用于神经性皮炎、重症带状疱疹神经痛、荨麻疹、慢性湿疹等皮肤病的治疗，剂量为多虑平25 mg，每日3次口服[14]。不良反应主要为轻微口干、头昏。它有很强的抗H1受体作用，比传统的抗组胺药苯海拉明强100倍，是赛庚啶的11倍,与H1受体的结合力为一般抗组胺药的800倍。

本研究发现：炎性细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α与炎症抑制细胞因子IL-10在ACD患者的血清中均呈现高表达现象，考虑可能是由于治疗前持续高表达的IL-1、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子，刺激IL-10的高表达来对抗产生的炎症反应。孙国华等在对前列腺增生及前列腺癌组织中IL-10的表达研究中得出了相似的结论[14]。随着ACD患者的治疗，促炎因子的水平下降，这种对抗作用减退而使IL-10的水平得到下降。

对C组患者的观察发现，针对基础病治疗后，患者的Hb水平虽有所提高，但是与治疗前进行配对t检验结果显示无统计学意义(P＞0.05)。这种提高考虑是基础病得到改善后，机体内部调节所致。

与C组相比，各治疗组患者治疗后的血清中Hepcidin与IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α的水平均显著下降；而患者Hb明显上升，差异具有统计学意义(P＜0.05)。这说明多虑平、EPO及二者的联合应用均可降低血清Hepcidin及上述细胞因子水平，随着血清Hepcidin的下降，使血清中可以利用的铁增加，故贫血得以改善。

SD组结果显示：单纯给予多虑平治疗后，患者的血清Hepcidin及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子水平较治疗前明显下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；而Hb水平较治疗前明显上升，差异具有统计学意义(P＜0.05)。其机理可能为多虑平通过下调血清IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子水平降低Hepcidin的表达，进而使患者的Hb升高。

SE组结果显示：单用EPO治疗后，患者的血清Hepcidin及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子水平较治疗前明显下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；而Hb水平较治疗前明显上升，差异具有统计学意义(P＜0.05)。本结果与国内外众多学者研究一致。其机理为EPO可以降低血清中的hepcidin及血清中的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子水平，有助于改善贫血症状。

本研究结果还显示：多虑平联合EPO治疗组(DE组)治疗后与SD、SE组治疗后相比较，患者血清中Hepcidin及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子的水平下降更明显；而Hb的升高也更为明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而SD组与SE组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。这说明在降低患者血清hepcidin及上述细胞因子的水平方面，EPO与多虑平可能存在某种协同效应。即二者联合治疗ACD的效果明显优于两药物的单独使用。

综上所述，多虑平可以降低hepcidin及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子的血清水平。多虑平与EPO的联合治疗效果明显优于两药物的单独使用，其机理可能为两者在对ACD的治疗方面存在协同效应或叠加结果，为本研究治疗ACD患者的最佳方法。但多虑平联合EPO这一新的治疗方法能否缩短ACD的治疗时间、减少EPO的剂量以及二者之间的生物学协同机制，尚有待进一步研究。此外，由于本实验系小样本、短期临床研究，单用多虑平能否有效治疗ACD，还需要大量更深入、细致的研究来加以印证。

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（2014-11-03收稿）

作者投稿系统http∶//xb.lzmc.edu.cn/

Clinical study of treatment of anemia of chronic disease by doxepin and erythropoietin

Su Tingting，He Yunqi1
Department of Hematology,the First People’s Hospital of Xinxiang;1Department of Hematology,the First People’s Hospital of Zunyi

Objective:To detect the changes of serum hepcidin,IL-1,IL-6,IL-10 and TNF-α in treatment of anemia of chronic disease(ACD)by doxepin to preliminarily explore its the mechanism.Methods:Sixty patients were divided into control group doxepin treatment group，EPO treatment group and doxepin combined EPO treatment group.The blood routine of the fresh samples were measured by automated blood analyzers and the levels of hepcidin,IL-1,IL-6,IL-10 and TNF-α in serum were detected by ELISA.Results:Compared with control group,the serum levels of above factors in treatment groups were significantly reduced(P＜0.05). Compared to EPO treatment group,serum levels of above factors in doxepin treatment group were not significantly reduced(P＞0.05),but significantly reduced in doxepin combined EPO treatment group(P＜0.05).The hemoglobin level was also significantly increased in combined group.Compared with doxepin treatment group,in doxepin combined EPO treatment group the serum levels of above factors in Doxepin combined EPO treatment group were significantly reduced while the hemoglobin level was significantly increased(P＜0.05).Conclusion: Doxepin may reduce the serum levels of hepcidin.in ACD patients.Doxepin combined EPO seems much better than single use of EPO or doxepin in treating patients with ACD.

ACD;Erythropoietin;Doxepin;Hepcidin

R556.9

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.02.011

苏婷婷（1988-），女，住院医师，硕士，E-mail:sutingtiag 2010@163.com