卵泡刺激素及其受体对卵巢癌细胞株的增殖作用

刘晓梅，郑桂英

卵泡刺激素及其受体对卵巢癌细胞株的增殖作用

刘晓梅1*，郑桂英2

目的 研究卵泡刺激素(FSH)对卵巢癌细胞株的增殖作用，探讨FSH在卵巢上皮性肿瘤(OET)发生、发展过程中的潜在生物学作用机制。方法 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养HO8910细胞及SKOV3细胞；采用免疫荧光法检测HO8910细胞及SKOV3细胞卵泡刺激素受体(FSHR)的表达；以0 IU/L的FSH作为对照组，不同浓度FSH分别培养HO8910细胞和SKOV3细胞不同时间后，MTT比色法测定各组吸光度值A，并比较各实验组的增殖指数(增殖指数=实验组吸光度(A)/对照组吸光度(A)×100%)；以最佳FSH浓度为实验组，等量培养液替代作为对照组，分别培养最佳时间，用流式细胞仪分别检测实验组及对照组细胞周期分布。结果 ①HO8910细胞FSHR表达阳性，特异性位于细胞核周及细胞质内；SKOV3细胞FSHR表达阴性；②不同浓度FSH作用于HO8910细胞24 h、48 h、72 h时，其A值均较对照组明显升高，其增殖程度与FSH呈浓度依赖效应，40 IU/L FSH培养48 h时，细胞增殖指数最高(P<0.05)，随着FSH浓度升高(直至160 IU/L)，该细胞株的增殖并未继续增加。SKOV3细胞各实验组A值均较对照组略有升高，40 IU/L FSH培养48 h时，细胞增殖指数最高(P<0.05)，但未表现出明显的FSH浓度依赖效应;③FSH浓度为40 IU/L时，培养HO8910细胞及SKOV3细胞48 h，两种细胞G0/G1期比例均减少，S期及G2/M期比例均增加(P<0.05)。而且FSH对HO8910促进细胞分裂作用较SKOV3更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 通过建立FSH作用于HO8910和SKOV3两种细胞模型，证实FSH与FSHR均与卵巢癌的增殖相关；FSH对FSHR表达阳性的卵巢癌细胞作用呈剂量效应；FSH通过促进细胞周期时相变化促进卵巢癌细胞增殖，且当FSHR阳性时，细胞周期变化更明显。

卵巢癌细胞；卵泡刺激素；卵泡刺激素受体

0 引言

卵巢癌是妇科最致命的恶性肿瘤，其发病率虽低于宫颈癌和内膜癌，但其死亡率明显超过宫颈癌与内膜癌死亡率之和[1]。卵巢癌约占卵巢肿瘤的10%～20%，卵巢肿瘤发生在绝经前妇女仅7%为恶性，而在绝经后妇女30%为恶性。卵巢癌发病高峰年龄为56～60岁，其中大约90%为上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)[2]。由于卵巢位于盆腔深处，解剖部位相对隐蔽，组织发生来源复杂，故其疾病早期缺乏相对特异症状及确诊特异指标，使得大多数患者缺乏特异的早期诊断措施，确诊时约70%的妇女处于肿瘤晚期[3]，严重影响了其预后，其5年生存率晚期比早期下降超过70%[4]。因此，尽早查明卵巢癌的发病原因十分重要。

国外有学者研究发现,第一次妊娠后，每再增加一次足月妊娠，卵巢癌发病风险能降低10%～16%[5-6]，口服避孕药的妇女与未用者相比卵巢癌风险减少30%[7-9]，提示低卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)环境对卵巢癌的发生可能有一定的保护作用。围绝经期仍有排卵的妇女，在多数周期中FSH水平升高，呈波动型；绝经后雌激素水平降低，诱导下丘脑释放促性腺激素释放激素增加，刺激垂体释放FSH增加，而80%以上的上皮性卵巢癌发生在围绝经期及绝经后妇女[10-12]，推测高FSH环境与卵巢癌的发生有一定的内在联系。然而，卵巢癌的发病原因尚不明了，FSH在卵巢癌发展的独立作用仍然令人困惑。本文通过构建FSH作用于FSHR阳性及阴性的卵巢癌细胞株体外模型，探讨FSH与EOC发生、发展的关系及潜在生物学作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 HO8910人卵巢浆液性囊腺癌细胞株，由吉林大学基础医学院病理学重点实验室馈赠，SKOV3人卵巢浆液性囊腺癌细胞株，购于中国科学院北京细胞库。FSH 及FSHR单克隆抗体(兔抗人)均购于美国SIGMA公司,CY3荧光二抗(羊抗兔)购于中国武汉博士德公司。RPMI 1640培养基及胰蛋白酶为美国GIBCO；FBS胎牛血清为杭州四季青生物制品公司；PI 碘化丙碇、MTT噻唑蓝均购于美国SIGMA公司。荧光显微镜为OLYMPUS BX 51；日本全自动酶标仪为美国BIO-TEK；流式细胞仪为美国Beckman-Coulter。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HO8910细胞及SKOV3细胞置于含10%FBS的RPMI 1640培养液中，37 ℃、5%CO2饱和湿度恒温培养箱中培养，用胰蛋白酶消化后按1∶3的比例传代，每3天传代1次，取对数生长期的细胞用于实验研究。

1.2.2 免疫荧光法检测HO8910细胞及SKOV3细胞FSHR的表达 将高压后的玻片放入无菌24孔板内，取对数生长期HO8910细胞及SKOV3细胞，胰酶消化后调整浓度为1.2×105/mL，按每孔500 μL接种于无菌24孔培养板中，置于37 ℃、5%CO2恒温箱中培养。每种细胞设3个重复孔。显微镜下观察细胞融合率为50%～60%，4%多聚甲醛室温固定，细胞水化，蛋白酶K消化修复，3%H2O2封闭，5%山羊血清封闭，加一抗(兔抗人FSHR单克隆抗体)孵育后加二抗(羊抗兔CY3荧光二抗)孵育。Hotrest复染后水性封片剂封片。荧光显微镜上机检测两种细胞FSHR的表达情况。

1.2.3 MTT法检测FSH对HO8910细胞及SKOV3细胞的增殖 取对数生长期HO8910细胞及SKOV3细胞，调整浓度为5×104/mL，每孔100 μL分别接种于无菌96孔培养板中，37 ℃、5%CO2恒温箱中培养。24 h后接种细胞的孔更换为无血清培养液饥饿24 h促细胞同步化。实验组每组分别加不同浓度FSH溶液200 μL，终浓度分别为10、20、40、80、160 IU/L；以等量的细胞培养液替代FSH溶液作为对照组。分别检测不同浓度FSH对2种细胞培养24、48、72 h时细胞增殖情况的影响。每组设5个平行孔。FSH作用结束时，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，恒温箱内孵育4 h，每孔加150 μL DMSO后震荡10 min。选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度值，记录结果后进行比较。实验重复3次，取平均值。

结果判定:细胞增殖指数(%)=实验组吸光度(A)/对照组吸光度(A)×100%。判定FSH作用于HO8910细胞及SKOV3细胞的最佳药物浓度及时间。

1.2.4 流式细胞仪检测FSH作用HO8910及SKOV3细胞后细胞周期分布 以“1.2.3”项中选出的最佳FSH浓度和作用时间作用于细胞作为实验组，以等量的培养液替代FSH溶液作为对照组，分别收集对照组及实验组的HO8910细胞及SKOV3细胞，各约(2～3)×106个，洗涤并固定。离心后细胞沉淀加入PI染液(内含RNA酶)1 mL，欲检测样品用30目尼龙网过滤，上机检测各组细胞的周期分布。

2 结果

2.1 免疫荧光法检测HO8910及SKOV3细胞FSHR的表达 结果判定:红色荧光表示FSHR表达阳性。HO8910细胞免疫荧光检测FSHR为阳性，特异性位于细胞核周及细胞质内，见图1。SKOV3细胞免疫荧光检测FSHR为阴性，见图2。

图1 HO8910细胞FSHR免疫荧光染色阳性

图2 SKOV3细胞FSHR免疫荧光染色阴性

2.2 MTT法测定FSH对HO8910细胞及SKOV3细胞的增殖 不同浓度FSH分别培养HO8910细胞和SKOV3细胞不同时间后，MTT比色法测定各组吸光值A，并分别比较各实验组的增殖指数。增殖指数=实验组吸光度(A)/对照组吸光度(A)×100%。见表1～表4。

由表1～表4可见，①不同浓度FSH作用于HO8910细胞24、48、72 h时，其A值均较对照组明显升高，其增殖程度与FSH浓度呈浓度依赖效应，40 IU/L FSH 培养48 h时，细胞增殖指数最高(P<0.05)，其后随着FSH浓度增加(直至160 IU/L)，该细胞株的增殖并未继续增加，虽然仍有促进作用，但较40 IU/L时有所减弱；②不同浓度FSH作用于SKOV3细胞24、48、72 h时，其A值均较对照组略有升高，40 IU/L FSH培养48 h时，细胞增殖指数最高(P<0.05)，但未表现出明显的FSH浓度依赖效应。

表1 FSH作用HO8910细胞的吸光值A

表2 FSH作用HO8910组间细胞增殖指数比较(%)

表3 FSH 作用SKOV3细胞的吸光值A

表4 FSH作用SKOV3组间细胞增殖指数比较(%)

注：*与对照组比较，P<0.05

2.3 流式细胞仪检测HO8910细胞及SKOV3细胞的细胞周期分布 将等量HO8910细胞及SKOV3细胞分别接种至培养瓶中，细胞贴壁后进行同步化处理。根据“2.2”项结果，两种细胞均以40 IU/L FSH作用48 h作为实验组，以等量培养液替代作为对照组，流式细胞仪检测HO8910细胞株和SKOV3细胞株细胞周期情况，见表5及图3、图4。

表5 两组HO8910、SKOV3细胞周期分布(%)

图3 FSH作用HO8910细胞后其细胞周期分布

图4 FSH作用SKOV3细胞后其细胞周期分布

结果表明，①FSH作用于HO8910及SKOV3后，两种细胞G0/G1期比例均减少，S期比例均增加，G2/M期比例均增加，以上差异均有统计学意义(P<0.05)；②FSH对HO8910(FSHR+)促进细胞分裂作用较SKOV3(FSHR-)更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

卵巢癌病因复杂，目前说法不一，传统说法包括卵巢癌发生的遗传学说、持续排卵学说、高促性腺素学说以及卵巢癌的输卵管起源学说等。近年来有学者提出，浆液性卵巢癌发生学的二元论模型，即低级别(高分化)浆液性卵巢癌发生存在多步骤过程，有前体病变，从良性转变到交界性，再到恶性的癌变；而高级别(低分化)浆液性卵巢癌则直接起源于卵巢表面上皮或包涵囊肿，缺乏前体病变。而其遗传学特征亦存在差异：在低级别浆液性癌K-RAS、B-RAF、P21等基因表达谱与交界性肿瘤相似；而高级别浆液性癌中P53及染色体不稳定性更为常见，基因表达谱与交界性肿瘤明显不同。传统观念认为，激素受体表达阳性的癌细胞分化较好，而本实验中HO8910细胞虽为低分化浆液性腺癌，即属于高级别癌，但经免疫荧光法检测其FSHR表达为阳性，可见FSHR与高级别卵巢癌之间仍存在一定的联系。

众所周知，FSH通常与FSHR特异性结合发挥活性作用，而卵巢癌高发于FSH水平升高的围绝经期及绝经后期妇女，因此，推测高FSH环境与卵巢癌的发生可能有一定的内在关系。在女性正常月经周期中，排卵前FSH在血中含量仅为5～20 IU/L，而排卵前虽升高但不超过30 IU/L，绝经后或卵巢功能衰退患者血FSH多>40 IU/L。本实验中选取浓度为0～160 IU/L的FSH溶液作用于上皮性卵巢癌细胞株HO8910及SKOV3，利用MTT比色法检测各组细胞的增殖情况，结果发现：当FSH 浓度较低时，对以上细胞虽略有促进增殖作用，但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；当FSH 浓度为40 IU/L时，细胞增殖程度最高，且仅此时与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示，较高浓度的FSH可能为卵巢癌的诱导因素，支持Stadel等[13]提出的卵巢癌发生促性腺激素假说。其后在直至160 IU/L的FSH浓度范围内，这两种卵巢癌细胞株的增殖并未继续增加，虽然仍有促进作用，但较浓度为40 IU/L时却有所减弱，不排除与培养基中营养物质耗竭有关。

关于卵巢癌发病原因的各种学说，均与高FSH环境有关。本实验构建了FSHR表达阳性和阴性的细胞模型，对两种细胞分别给予不同浓度的FSH作用后，观察到两种细胞均有增殖，但在一定浓度的FSH范围内，FSHR表达阳性的HO8910细胞存在浓度依赖效应，符合界定致畸、致突变及致癌动物模型中的剂量效应关系。如前所述，在卵巢癌发生学二元论模型中低级别卵巢癌发生存在多步骤过程，有前体病变，从良性转变到交界性，再到恶性的癌变，是一个环境累积的诱变过程。卵巢癌高发于40～60岁女性，从生物学上恰处于流行病学中绝经前后FSH开始升高及自高分泌峰值逐渐衰退环境。而在FSHR表达阴性的SKOV3细胞虽然也有增殖，但未表现出此浓度依赖效应，推测与二元论学说中的高级别卵巢癌缺乏前体病变，高FSH环境直接诱发基因突变相关。

本实验进一步利用流式细胞仪检测HO8910细胞株和SKOV3细胞株细胞周期分布情况，根据MTT比色法的实验结果，选取40 IU/L的FSH溶液作用48 h作为实验组，以等量培养液替代作为对照组，结果两种细胞均有由G0/G1期向S期及G2/M期转化趋势，但FSH对HO8910促进细胞分裂作用较SKOV3更明显。此结果提示，FSH可以通过促进细胞周期时相变化而促进卵巢癌细胞增殖，且与FSHR阴性细胞相比，FSHR阳性细胞的周期时相变化更明显，进一步支持卵巢癌发生的二元论学说。

综上所述，通过建立FSH作用于HO8910和SKOV3两种细胞模型，证实了FSH、FSHR均与卵巢癌的增殖相关。而且FSH对FSHR表达阳性的卵巢癌细胞作用呈剂量效应。FSH通过促进细胞周期时相变化而促进卵巢癌细胞增殖，且当FSHR阳性时，细胞周期变化更明显。

[1] Wingo PA,Tong T,Bolden S.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,1995,45(8):30.

[2] Holschneider CH,Berek JS.Ovarian cancer: epidemiology,biology,and prognostic factors[J].Semin Surg Oncol,2000,19(3):10.

[3] June Y,Hou Michael G,Herbert Yu,et al.Neoadjuvant chemotherapy lessens surgical morbidity in advanced ovarian cancer and leads to improved survival in stage IV disease [J].Gynecologic Oncology,2007,10(5): 211-217.

[4] Heintz AP,Odicino F,Maisonneuve P,et al.Carcinoma of the ovary.FIGO 6th Annual Report on the Results of Treatment in Gynecological Cancer[J].Int J Gynaecol Obstet,2006,9:161-192.

[5] Hankinson SE,Colditz GA,Hunter DJ,et al.A prospective study of reproductive factors and risk of epithelial ovarian cancer[J].Cancer,1995,76:284-290.

[6] Risch HA,Marrett LD,Jain M,et al.Differences in risk factors for epithelial ovarian cancer by histologic type.Results of a case-control study[J].Am J Epidemiol,1996,144:363-372.

[7] Tung KH,Wilkens LR,Wu AH,et al.Effect of anovulation factors on pre- and postmenopausal ovarian cancer risk: revisiting the incessant ovulation hypothesis[J].Am J Epidemiol,2005,161:321-329.

[8] Modugno F,Ness RB,Allen GO,et al.Oral contraceptive use,reproductive history,and risk of epithelial ovarian cancer in women with and without endometriosis[J].Am J Obstet Gynecol,2004,191:733-740.

[9] Bosetti C,Negri E,Trichopoulos D,et al.Long-term effects of oral contraceptives on ovarian cancer risk[J].Int J Cancer,2002,102:262-265.

[10]Scully RE,Young RH,Clement PB.Tumors of the ovary,maldeveloped gonads,fallopian tube,and broad ligament.In:Atlas of tumor pathology[M].Washington,DC: Armed Forces Institute of Pathology，1998:3

[11]Berek JS,Hacker NF.Practical gynecologic oncology[M].4th ed.Philadelphia,PA: Lippincott Williams & Wilkins,2005:443-541.

[12]Pecorelli S,Odicino F,Maisonneuve P,et al.Carcinoma of the ovary.Annual report on the results of treatment of gynaecological cancer,International Federation of Gynecology and Obstetrics[J].J Epidemiol Biostat,1998,23(3):75-102.

[13]Stadel BV.The etiology and prevention of ovarian cancer[J].Am J Obstet Gynecol,1975,123:772-774.

Effects of FSH and FSHR on proliferation of ovarian cancer cell line

LIU Xiao-mei1*,ZHENG Gui-ying2

(1.Department of Gynecology and Obstetrics,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China; 2.The Second Clinical Medical College of Jilin University,Changchun 130021,China)

Objective To study the effects of FSH and its receptor on the proliferation of ovarian cancer cell line，then discuss the potential biological mechanisms and function of FSH during the occurrence and development of the ovarian epithelial tumors.Methods We cultured HO8910 cells and SKOV3 cells with RPMI1640 culture medium which contained 10% fetal bovine serum.Then the follicle-stimu/lating hormone receptor (FSHR) expression of HO8910 and SKOV3 cells was assayed by immunofluorescence.0 IU/L of FSH was taken as a control group,the proliferation of HO8910 and SKOV3 cells cultured in different concentrations of FSH was assayed at different time points by Methyl thiazolyltetrazolium (MTT).Then the cells were cultured with the best FSH concentration at the best time,the cell cycle distribution was detected by flow cytometry (Fcm).Results ①The FSHR expression of HO8910 cell was positive,it located in the cytoplasm and around the nucleus; SKOV3 cell was negative.②At 24 h,48 h,72 h after HO8910 cells with different concentrations of FSH,the absorbance was significantly higher than that of control group,the degree of proliferation was in a concentration dependent manner.When FSH concentration was 40 IU/L,the cell proliferation index was the highest at 48 h (P<0.05).The proliferation of the cells did not increase,along with the increase of FSH concentration (up to 160 IU/L)②At 24 h,48 h,72 h after SKOV3 cells with different concentrations of FSH,the absorbance was slightly higher than that of control group,when FSH concentration was 40 IU/L,the cell proliferation index was the highest at 48 h(P<0.05),but the degree of proliferation was not in a concentration dependent manner.③HO8910 and SKOV3 cells were cultured with 40 IU/L of FSH for 48 h,G0/G1-phase fraction both reduced,S phase and G2/M phase fraction both increased (P<0.05),and the effects on HO8910 were more obvious than SKOV3 (P<0.05).Conclusion FSH and FSHR are confirmed to associate with the proliferation of ovarian cancer through the establishment of FSH acting on the HO8910 and SKOV3 cells.FSH has a dose effect on ovarian cancer cells with positive FSHR expression.FSH plays an important role in the promotion of cell cycle phase changes,especially on FSHR-positive cells.

Ovarian cancer cell line; Follicle-stimulating hormone; Follicle-stimulating hormone receptor

2014-07-23

1.中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004；2.吉林大学第二临床医学院，长春130021

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201504006