骨桥蛋白在SLE肾损害Th17细胞异常中的作用

罗妙旋，米向斌，张堂德，邱贤文，张亚杰

骨桥蛋白在SLE肾损害Th17细胞异常中的作用

罗妙旋1，米向斌1，张堂德1，邱贤文1，张亚杰2

目的探讨骨桥蛋白（OPN）在系统性红斑狼疮（SLE）肾损害患者Th17细胞异常中的作用。方法取40例健康者和50例SLE患者（其中，伴肾损害SLE患者25例、无肾损害的SLE患者25例的血清和肝素钠抗凝血，用ELISA法检测血清中OPN和白介素-17（IL-17）的表达水平，用流式细胞术检测外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞的阳性率，并分析各组间差异，以及各因素间的相互关系。结果①SLE肾损害患者组的OPN、IL-17水平和CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞阳性率显著高于无肾损害的SLE患者组、健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；无肾损害的SLE患者组和健康对照组间OPN、IL-17、CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞阳性率的差异均无统计学意义（P＞0.05）。②血清中OPN分泌与IL-17水平、CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞阳性率之间均成明显正相关性（P＜0.01）。结论外周血中的OPN对SLE肾损害患者的Th17细胞异常起着重要的调控作用。

系统性红斑狼疮；骨桥蛋白；Th17细胞

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种常见的累及多系统、多器官的自身免疫性疾病。细胞因子分泌和复杂调控网络的异常是SLE免疫紊乱发生和各系统、器官的慢性炎症及器官损害的直接原因［1］。辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17细胞），通过其主要效应分子白介素（interleukin，IL）-17对SLE靶器官炎症反应的增强作用，进而促进了靶器官的炎性损伤和SLE的发生发展［2］。特别是SLE肾损害患者中，Th17细胞异常活化并且过度分泌IL-17起着重要作用［3］。但是，SLE肾损害Th17细胞异常活化和分泌IL-17的确切机制还不完全清楚。近来的研究［4］显示，骨桥蛋白（osteopontin，OPN）作为Th17细胞异常活化和炎性因子分泌的重要调控器，在SLE疾病发生和靶器官炎性损伤中，特别是SLE肾损害中起着重要作用。现通过ELISA法研究伴肾损害SLE患者、无肾损害的SLE患者和健康人血清中OPN和IL-17分泌水平、外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞阳性率的差异及相互关系，探讨OPN在SLE，特别是肾损害患者中Th17细胞过度活化和表达IL-17增强中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 病例资料共收集50例SLE患者，全部符合美国风湿学会的SLE诊断标准（1997年修订）。其中，临床出现蛋白尿者为SLE肾损害患者，反之为无肾损害的SLE患者。SLE肾损害患者共25例，女23例，男2例，年龄13～57（29.56±12.11）岁；无肾损害的SLE患者25例，女22例，男3例，年龄15～77（32.36±14.31）岁；健康对照40例，均为南方医科大学珠江医院体检中心健康体检者，无自身免疫性疾病家族史，女37例，男3例，年龄18～54（28.47±13.84）岁。各组的性别和年龄构成的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 主要仪器与试剂实验所需仪器由中山大学孙逸仙医院林百欣医学研究中心提供：多动能酶标仪（美国Molecule Device公司，SpectraMax M5）；流式细胞分析仪（美国BD公司，FACSVerse）。人OPN、IL-17因子ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；Th17细胞检测试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）；CD3、CD8抗体、IL-17A抗体、IgG1（美国eBioscience公司）。

1.3 方法

1.3.1 用ELISA法检测血清中OPN、IL-17水平

收集无抗凝全血3～4 m l，4℃过夜后于4℃、3 000 r／min离心10 min，取上清液于－20℃保存；操作步骤按照产品说明书严格进行。取450、540 nm波长处的光密度值之差值为实际光密度值。制作其标准曲线并计算出最终的样本浓度。

1.3.2 用流式细胞术检测外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞的阳性率 用肝素钠抗凝管采集静脉血1～2 m l，室温放置，4 h内检测。基本步骤如下：取250μl全血标本，用RPMI 1640等体积稀释到500μl；在标本中加入刺激剂佛波酯PMA（250×）2 μl和阻断剂BFA（250×）2μl；37℃、5%CO2培养箱培养4～6 h，期间相隔1～2 h混匀1次；设置检测样品管1和对照管2，分别加入100μl培养好的全血，以及CD3、CD8抗体，4℃避光孵育30 min；加入破膜剂100μl，室温孵育15 min；加入3 ml染色缓冲液，1 500 r／min离心5 min弃上清液收集细胞；涡旋，加入固定液100μl，检测样品管1中加入IL-17A抗体，对照管2中加入同型对照鼠IgG1，室温孵育20min；加入3m l染色缓冲液，1 500 r／min离心5 min，弃上清液收集细胞；用0.5 m l PBS重悬后立即上机检测CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞的阳性率。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。采用One-Way ANOVA方差分析及其两两比较方法分析各组间细胞因子及CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞阳性率的差异。采用Pearson线性相关分析法分析各因素间相关关系。

2 结果

2.1 伴肾损害的SLE患者血清中OPN水平均显著升高与健康对照组、无肾损害SLE组相比，伴肾损害SLE组外周血血清中OPN水平明显增高，差异均有统计学意义（F＝42.032，P＜0.01）；无肾损害的SLE患者组与健康对照组相比，血清中OPN水平差异无统计学意义（F＝42.032，P＞0.05）。见表1。

表1 各组血清OPN、IL-17水平和外周血CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞阳性率

表1 各组血清OPN、IL-17水平和外周血CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞阳性率

与伴肾损害SLE组比较：**P＜0.01

检测指标伴肾损害SLE组（n＝25）无肾损害SLE组（n＝25）健康对照组（n＝40）OPN（pg／m l）44.70±23.46 15.66±11.27**13.31±5.96**IL-17（pg／ml）164.47±128.62 52.61±28.41**37.98±26.37**CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞（%）1.89±1.09 37.98±26.37**0.29±0.14**

2.2 伴肾损害的SLE患者血清中IL-17水平均显著升高与健康对照组、无肾损害的SLE组相比，伴肾损害的SLE组外周血血清中IL-17水平明显增高，差异均有统计学意义（F＝25.768，P＜0.01）；无肾损害的SLE患者组与健康对照组相比，血清中IL-17水平差异无统计学意义（F＝25.768，P＞0.05）。见表1。

2.3 伴肾损害的SLE患者外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞的阳性率显著升高伴肾损害的SLE患者外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞的阳性率较健康对照组、无肾损害的SLE患者均明显增高（F＝58.878，P＜0.01）；无肾损害的SLE患者外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞的阳性率与健康对照组间差异无统计学意义（F＝58.878，P＞0.05）。见表1、图1。

2.4 血清中OPN与IL-17以及CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞阳性率的相关性血清中OPN与IL-17水平、CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞阳性率之间均成明显正相关性（r＝0.442、0.630，P＜0.01）。

3 讨论

SLE是一种以多种炎性细胞因子参与的多靶器官损害为特征的自身免疫性疾病。特别是SLE肾损害，免疫复合物形成、免疫细胞和细胞因子等免疫异常导致的靶器官细胞浸润和炎性损伤是其发病的关键因素。Th17细胞及其分泌的多种炎性细胞因子在SLE疾病的免疫紊乱及器官的炎性损伤中有非常重要的作用［5］。有学者发现SLE患者外周血及受累器官Th17细胞及IL-17均高表达。而且在SLE活动期其表达更高，而经过治疗后其表达有所降低［6］。不仅SLE患者IL-17的分泌增加和分泌IL-17的CD4＋、CD3＋CD4－CD8－T细胞增多，而且分泌IL-17的Th17细胞也存在于SLE患者炎性损伤的肾组织中［7］。本研究显示，SLE肾损害患者外周血CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞的阳性率及血清中IL-17水平较无肾损害SLE患者组、健康对照组均显著升高。但是，无肾损害SLE患者组、健康对照组间外周血CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞的阳性率及血清中IL-17水平无明显差异。这些结果均提示Th17细胞和其主要效应分子IL-17可能通过促进炎细胞向靶器官的迁移，导致SLE受累器官的炎性损伤，特别是肾脏的炎性损伤，最终导致SLE的发生发展。

另一方面，OPN是由活化的T细胞、树突状细胞和巨噬细胞表达的一种多效性细胞因子，正常情况下表达甚微，但是在炎症期间可以大量表达［8］。近年来的研究［9］表明，OPN表达不仅可以增强Th1型免疫反应并抑制Th2细胞因子的表达，还可以通过对IL-17介导的自身免疫性炎症的调控，导致自身免疫性疾病中靶器官的炎性损伤。研究［10］显示OPN与多发性硬化症、类风湿性关节炎和SLE等自身免疫性疾病密切相关。不仅SLE患者血清中OPN分泌明显增加，而且OPN分泌和SLE病情活动程度评分呈明显正相关性［11］。同时，研究［12］显示，OPN在SLE肾损害中发挥重要作用［12］。本研究结果显示，SLE肾损害患者血清中OPN水平比无肾损害SLE患者和健康对照者明显增高，但是无肾损害SLE患者和健康对照间OPN水平无明显差异。而且，血清OPN水平与CD3＋CD8－IL-17A＋T细胞的阳性率及血清中IL-17水平均呈明显正相关性。这些结果说明，OPN的产生和SLE的疾病进展和肾脏炎性损伤密切相关。

［1］ Brugos B，Vincze Z，Sipka S，et al.Serum and urinary cytokine levels of SLE patients［J］.Pharmazie，2012，67（5）：411－3.

［2］ Martin JC，Baeten D L，Josien R.Emerging role of IL-17 and Th17 cells in systemic lupus erythematosus［J］.Clin Immunol，2014，154（1）：1－12.

［3］ Vincent F B，Northcott M，Hoi A，et al.Clinical associations of serum interleukin-17 in systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Res Ther，2013，15（4）：R97.

［4］ Morimoto J，Kon S，Matsui Y，et al.Osteopontin；as a target molecule for the treatment of inflammatory diseases［J］.Curr Drug Targets，2010，11（4）：494－505.

［5］ Shin M S，Lee N，Kang I.Effector T-cell subsets in systemic lupus erythematosus：update focusing on Th17 cells［J］.Curr Opin Rheumatol，2011，23（5）：444－8.

［6］ Yang J，Chu Y，Yang X，et al.Th17 and natural Treg cell population dynamics in systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum，2009，60（5）：1472－83.

［7］ Apostolidis S A，Crispín J C，Tsokos G C.IL-17-producing T cells in lupus nephritis［J］.Lupus，2011，20（2）：120－4.

［8］ Kahles F，Findeisen H M，Bruemmer D.Osteopontin：A novel regulator at the cross roads of inflammation，obesity and diabetes［J］.Mol Metab，2014，3（4）：384－93.

［9］ Leng R X，Pan H F，Ye D Q.Osteopontin receptor-dependent regulation of Th1 and Th17 responses in autoimmune diseases：comment on the article by Chen etal［J］.Arthritis Rheum，2011，63（2）：568.

［10］Chen G，Zhang X，Li R，et al.Role of osteopontin in synovial Th17 differentiation in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2010，62（10）：2900－8.

［11］Rullo O J，Woo JM，Parsa M F，et al.Plasma levels of osteopontin identify patients at risk for organ damage in systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Res Ther，2013，15（1）：R18.

［12］王崇宇，刘苗生，祈露霞.骨桥蛋白血清白细胞介素-8与狼疮肾炎的病理临床关系［J］.中华风湿病学杂志，2006，10（5）：313－4.

The role of osteopontin in abnormal Th17 cell in SLE patientsw ith renal damage

Luo Miaoxuan，Mi Xiangbin，Zhang Tangde，et al
（Dept of Dermatology，Zhujiang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510282）

Objective To investigate the regulatory role of osteopontin（OPN）in abnormal Th17 cells of systemic lupus erythematosus（SLE）patients.MethodsThe levels of OPN and interleukin-17（IL-17）in serum and the rate of CD3＋CD8－IL-17A＋T cell from 40 healthy controls and 50 SLE patients（25 SLE patientswith renal damage and 25 SLE patients without renal damage）were detected by ELISA and flow cytometry methods.Besides，difference between groups and interaction amongmultiple elements were analyzed.Results①The levels of OPN and IL-17 in serum，the rate of CD3＋CD8－IL-17A＋T cell in SLE patients with renal damage all obviously increased than SLE patientswithout renal damage and healthy controls（P＜0.01），while there was no differencebetween SLE patients without renal damage and healthy controls（P＞0.05）.②Meanwhile，significant positive correlation was shown between serum OPN and serum IL-17 level，CD3＋CD8－IL-17A＋T cell（P＜0.01）.ConclusionOPN plays an important regulatory role in abnormal Th17 cells of SLE patients with renal damage.

systemic lupus erythematosus；osteopontin；Th17 cell

R 593.24

A

1000－1492（2015）08－1165－04

2015－04－29接收

国家自然科学基金（编号：81201233、81000291）

1南方医科大学珠江医院皮肤科，广州 510280；

2广州医科大学附属第二医院肾内科，广州 510260

罗妙旋，女，硕士研究生；

米向斌，女，博士，主治医师，责任作者，E-mail：mitaiyang＠163.com