白藜芦醇对小鼠酒精性脂肪肝的防治作用及机制研究

陈 毅，胡成穆，唐丽英，李 浩，李 俊

白藜芦醇对小鼠酒精性脂肪肝的防治作用及机制研究

陈 毅1，胡成穆1，唐丽英1，李 浩2，李 俊1

目的观察白藜芦醇（RSV）对Lieber-DeCarli酒精液体饲料诱导的小鼠酒精性脂肪肝的作用，并初步探讨其可能的相关分子机制。方法6～8周龄雄性C57BL／6J小鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、RSV（10、30、100 mg／kg）组和谷胱甘肽（GSH，200 mg／kg）阳性对照组，造模的同时给予药物干预共10 d，实验结束后称取体重，处死小鼠，收集血液和肝脏，分离血清测定相关指标，病理切片观察肝脏的脂肪蓄积，免疫组化法检测脂肪分化相关蛋白（ADRP）的表达，Western blot法检测肝脏腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）及脂素（lipin1）的表达。结果与模型组比较，RSV组血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平显著降低（P＜0.01），但血清三酰甘油（TG）水平降低不明显；肝脏TG（低剂量：P＜0.05，中、高剂量：P＜0.01）和丙二醛（MDA）含量显著降低（P＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）活性显著升高（P＜0.01）。病理组织学结果显示RSV明显减轻肝脏脂肪变性，免疫组化法结果显示RSV能够抑制ADRP的表达，Western blot法结果表明RSV能激活AMPK活性，增加其磷酸化水平，并能抑制lipin1蛋白的表达。结论RSV对小鼠酒精性脂肪肝具有一定的保护作用，其机制可能与激活AMPK-lipin1通路有关。

白藜芦醇；酒精性脂肪肝；腺苷酸激活蛋白激酶；脂素

酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）为长期大量饮酒所致的一种慢性肝病，在酒精性肝病中最为常见。常伴随有肝细胞脂肪变性、肝细胞损伤及炎症细胞浸润，若继续饮酒，可进一步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌［1］。目前尚无有效的治疗药物，因此寻找一个防治酒精性脂肪肝发生发展的药物尤为重要。

白藜芦醇（resveratrol，RSV）是一种广泛存在于红酒、葡萄、花生等一些植物中的膳食多酚。其具有广泛的药理作用，包括抗癌、抗氧化、抗炎、抗血管新生、保肝等作用。研究［2］表明，RSV通过去乙酰化酶1（sirtuin 1，SIRT1）－腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）途径对酒精性肝脂肪变性有一定治疗效果。在摄入酒精的小鼠肝脏，RSV通过提高SIRT1基因表达水平，激活AMPK活性，从而减少肝脏脂质积累。

脂素（lipin）是脂质代谢的关键调控因子。2001年Peterfy et al［3］利用定位克隆技术在肝脏脂质营养不良（fld）小鼠中发现了该突变基因，命名为lipin基因。lipin1在脂质代谢调节中具有双向调控作用。一方面，lipin1作为三酰甘油合成所必须的一种磷脂酸磷酸酶（phosphatidic acid phosphatase，PAP），催化磷脂酸的去磷酸化，促进脂质的合成［4］；另一方面，lipin1作为一种转录协同刺激因子，与过氧化物酶体增生激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ）协同激活因子和PPARα共同促进脂肪酸的氧化［5］。近年来，对lipin1在肝脏脂质代谢的研究逐渐增加，有研究［6］表明，长期乙醇摄入会激活固醇调节元件结合蛋白-1（sterol regulatory element-binding proteins，SREBP-1），抑制AMPK活性，从而上调lipin1的表达，导致肝脏过多的脂质积累。该研究旨在观察RSV对Lieber-De-Carli酒精液体饲料诱导的小鼠AFL的作用并探讨相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物和饲料普通级雄性C57BL／6J小鼠共96只，购自安徽医科大学实验动物中心，6～8周龄，20～22 g，室温22～25℃，相对湿度55%～60%。Lieber-DeCarli酒精液体饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司，RSV购自上海沃凯化学试剂有限公司。

1.2 小鼠AFL模型的建立及分组给药造模过程包括Lieber-DeCarli液体饲料适应期（5 d）、造模期（10 d）、灌胃（1次）和取标本（1 d），总计16 d。小鼠随机分为6组：①正常对照组：每天给予对照液体饲料（不含酒精）；②模型组：给予Lieber-DeCarli酒精液体饲料；③RSV 10mg／kg组；④RSV 30 mg／kg组；⑤RSV 100mg／kg组；⑥阳性对照组：还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH，200 mg／kg）。RSV灌胃给药，GSH腹腔注射给药，连续给药10 d。各组小鼠造模期间每天观察精神活动、反应能力、毛色等一般状态。造模结束，第16天上午7～9时模型组酒精灌胃1次，对照组糊精灌胃，9 h后称重麻醉采血，离心取血清，肝脏称重后，分装，计算肝指数（肝重／体重×100%）。部分肝脏用4%多聚甲醛固定，剩余保存于－80℃冰箱备用。

1.3 血清和肝组织相关指标检测取血清按试剂盒说明书方法测定血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和三酰甘油（triglyceride，TG）活性。用0.9%的生理盐水制备10%肝匀浆，按试剂盒说明书方法测定肝匀浆上清液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、TG含量。

1.4 肝组织HE染色取肝脏相同部分用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察其病理变化。

1.5 免疫组化法检测ADRP的表达将小鼠肝组织切片经3%H2O2溶液封闭及微波修复后，用ADRP抗体4℃孵育过夜，再经生物素标记的二抗处理后，滴加HRP，然后DAB染色，苏木素复染，脱水、透明、封片。

1.6 W estern b lot法检测肝脏AMPK、p-AM PK、Lipin1相关蛋白的表达用RIPA裂解液于冰上提取组织蛋白，BCA试剂盒测定各样本蛋白浓度，蛋白煮沸变性后上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用湿性转膜法将蛋白转移至PVDF膜上。含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h后分别用一抗稀释液稀释的lipin1、p-AMPKα、AMPKα抗体4℃孵育过夜，洗膜3次，加入二抗稀释液稀释的辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育2 h，洗膜3次后加入化学发光液，采用Image Quant LAS 4000 mini成像系统自动曝光。

1.7 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析，多组资料间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 RSV对AFL小鼠体重和肝指数的影响造模前各组小鼠体重差异无统计学意义，造模结束后正常对照组小鼠体重自然增加，其它各组小鼠体重均有所减轻。模型组小鼠肝脏重量明显高于对照组。与正常对照组比较，模型组肝指数明显增加，肝脏指数在一定程度上可反映肝脏受损伤程度；RSV各用药小鼠肝脏指数较模型组有所降低，但差异无统计学意义，见表1。

2.2 RSV对AFL小鼠肝组织外观及病理改变的影响正常对照组小鼠肝脏无明显的脂滴形成，肝小叶结构正常；模型组小鼠肝脏内弥漫大量脂肪变性，细胞中可见大小不等，分布不均的脂滴空泡，有轻微的炎性细胞浸润。RSV（尤其是100 mg／kg）用药后明显减轻肝脏脂肪变性和炎性细胞浸润，脂滴空泡明显减少。见图1。

2.3 RSV对AFL小鼠肝组织SOD、MDA和TG的影响与正常对照组比较，模型组AFL小鼠肝脏SOD的活性明显降低，而MDA和TG的含量明显升高；与模型组比较，RSV显著降低AFL小鼠肝脏的MDA（F＝15.319，P＜0.01）和TG（F＝67.546，P＜0.01）水平，升高AFL小鼠肝脏SOD的活性（F＝8.351，P＜0.01），见图2。

2.4 RSV对AFL小鼠血清ALT、AST和TG的影响模型组小鼠血清ALT、AST和TG水平明显升高，RSV（30，100 mg／kg）降低AFL小鼠血清过高的ALT（F＝12.279，P＜0.01）、AST（F＝10.870，P＜0.01）水平。然而，与肝组织的TG水平有所不同，RSV对血清TG含量没有显著影响（F＝5.880，P＞0.05），见图3。

2.5 RSV对AFL小鼠肝组织ADRP表达水平的影响ADRP主要定位于成熟脂肪细胞胞膜上，对照组只有少数肝细胞ADRP表达阳性，AFL模型组小鼠肝脏ADRP有较强表达，RSV各给药组ADRP表达相对AFL模型组明显减轻，见图4。

表1 RSV对小鼠体重、肝重及肝指数的影响

表1 RSV对小鼠体重、肝重及肝指数的影响

与正常对照组比较：**P＜0.01

指标正常对照组模型组RSV给药组（mg／kg ）10 30 100阳性对照组F值体重（g）23.90±1.92 21.06±1.70 18.88±1.68 18.56±1.45 18.95±1.77 18.55±2.08 16.122肝重（g）0.984±0.168 1.154±0.137 1.015±0.126 1.001±0.132 1.012±0.121 0.989±0.131 1.922肝指数（%）4.101±0.510 5.485±0.526**5.404±0.762 5.392±0.585 5.349±0.568 5.361±0.710 12.167

2.6 RSV对AFL小鼠肝脏AMPK、p-AMPK、lipin1蛋白表达的影响结果显示模型组小鼠肝脏p-AMPK的水平显著降低，而RSV用药后p-AMPK蛋白的表达明显增加（F＝34.236，P＜0.01），见图5。

模型组小鼠肝脏lipin1蛋白表达增加，RSV用药后其表达下调（F＝190.507，P＜0.01）。这些结果均表明，RSV对小鼠酒精性脂肪肝的保护作用，可能与其激活AMPK活性，抑制lipin1蛋白的表达有关，见图6。

3 讨论

长期大量乙醇摄入会导致肝细胞脂肪合成增加和脂质在肝细胞沉积，从而形成AFL。本实验结果表明，乙醇促使小鼠肝指数增加，肝脏TG含量积聚，血清TG、ALT和AST的水平升高，肝细胞中过量脂滴形成和轻微的炎症产生，从而导致肝细胞脂肪变性。研究［7］表明，RSV能够减少小鼠肝脏中胆固醇和TG的积累，减少肝脏TG的合成。本实验结果显示，RSV通过降低血清ALT、AST的水平，减少肝脏脂质沉积，从而改善酒精性脂肪肝。然而，值得一提的是，本研究显示RSV对血清TG含量无显著影响。RSV对肝脏和血清TG含量影响差异的原因有待进一步研究。

脂肪分化相关蛋白（adipose differentiation-related protein，ADRP）在脂滴的合成和储存中具有重要作用。因ADRP比HE染色更易发现肝细胞微小脂滴，可作为酒精性脂肪肝形成的标志［8］。免疫组化结果表明，模型组小鼠肝脏ADRP表达显著增高，而RSV用药后，可明显降低表达过高的ADRP水平。表明RSV能够抑制脂滴的形成，缓解肝脏脂质沉积。

氧化应激和脂质过氧化对AFL的发生和发展同样起着重要作用。发生脂肪肝时，肝细胞内生成过多的活性氧（reactive oxygen，ROS），SOD的活性减弱，SOD反映了细胞清除ROS的能力。过多的ROS导致脂质过氧化，过量的自由基也使肝脏脂质过氧化增加，MDA生成增多，MDA能损伤细胞膜，影响细胞膜功能［9－10］。本研究表明，RSV显著提升SOD活性，降低肝脏过高的MDA。因此，RSV对AFL的保护作用可能部分与其抗氧化作用有关。

AMPK作为能量代谢的关键调节因子，被喻为“细胞能量调节器”，其活化形式为Thr-172位磷酸化，AMPK也是AFL发病的关键信号分子。AMPK的活化能增加脂肪酸氧化，减少脂肪合成［11－12］。如前所述，lipin1是脂质合成中的PAP，不论在动物还是人的酒精性脂肪肝中，肝脏的PAP活性都显著增加［13－14］，小鼠肝脏lipin1的缺失会加重酒精诱导的肝脏脂肪变性［15］。lipin1是AMPK介导的脂质代谢中一个重要的下游调节因子，AMPK-lipin1通路是AFL中的重要信号通路。乙醇抑制AMPK的活性，阻断lipin1信号通路，导致AFL的发生和发展［6，16］。本实验结果表明，乙醇显著抑制AMPK的活性，促进AFL小鼠肝脏lipin1的表达。RSV可显著提高AFL小鼠AMPK的磷酸化水平，下调lipin1的表达，改善AFL小鼠肝脏病变。这些结果表明RSV可能通过AMPK-lipin1信号通路发挥对AFL的保护作用。

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Protective effects and the potentialmechanism of resveratrol on alcoholic fatty liver in m ice

Chen Yi1，Hu Chengmu1，Tang Liying1，et al
（1School of Pharmacy，AnhuiMedical University，Hefei 230032；2Dept of Pharmacy，The Fourth Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230011）

Objective To evaluate the protective effectsof resveratrol（RSV）on alcoholic fatty liver（AFL）mice，and investigate the potentialmolecularmechanism.MethodsWe conducted vivo studies in C57BL／6Jmice fed with ethanol Lieber-DeCarli liquid dietand treated with RSV（10，30，100 mg／kg）and GSH（200 mg／kg）.ResultsThe results showed that RSV（30 or 100 mg／kg）treatment significantly attenuated hepatic steatosis with lowering activities of serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST）and levels of hepatic triglyceride（TG），increasing superoxide dismutase（SOD）activities，decreasingmalondialdehyde（MDA）content，although the levels of serum TG were not changed significantly.Immunohistochemistry analysis and HE staining showed that RSV suppressed the expression of adipose differentiation-related protein（ADRP）and reduced hepatic lipid accumulation.Western blot analysis showed that RSV stimulated AMP-activated protein kinase（AMPK）activity and inhibited lipin1 expression.ConclusionRSV has protective effects on alcoholic fatty liver，and the potentialmechanism mightbe involved in activation of AMPK-lipin1 signaling and its antioxidant roles.

resveratrol；alcoholic fatty liver；AMPK；lipin1

R 966；R 737.3；R 285.5

A

1000－1492（2015）08－1119－06

2015－04－14接收

安徽医科大学博士科研经费资助计划项目（编号：XJ201209）；安徽医科大学校科学研究基金资助项目（编号：2012xkj092）

1安徽医科大学药学院，合肥 230032

2安徽医科大学第四附属医院药剂科，合肥 230032

陈 毅，男，硕士研究生；

李 俊，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：lijun＠ahmu.edu.cn