异氟烷预处理对脑缺血大鼠脑保护作用研究

邱 焱，董 斌，蔡晓岚

异氟烷预处理对脑缺血大鼠脑保护作用研究

邱 焱1，董 斌2，蔡晓岚1

目的研究异氟烷预处理局灶性脑缺血成年大鼠模型，通过检测缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、血红素氧合酶1（HO-1）以及B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）表达水平揭示其脑保护作用。方法2月龄SD大鼠随机分为假手术组、单纯大脑中动脉闭塞模型组（MCAO组）、异氟烷预处理组（ISO组），缺血再灌注采用90 min大脑中动脉闭塞MCAO，MCAO之前ISO组进行30min异氟烷预处理，30min空气洗脱。再灌注24 h检测神经功能评分及脑梗死面积，MCAO建模后再灌注6、24、72 h收集大鼠脑皮层组织，Western blot法检测HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表达水平。结果MCAO组术后24 h改良神经损伤严重程度评分（mNSS评分）明显低于ISO组（P＜0.05）。再灌注24 h检测结果显示，ISO组神经损伤及脑梗死面积明显小于MCAO组（P＜0.05）。建模6、24 h后MCAO组和ISO组HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表达水平显著上升（P＜0.05），24 h达到峰值，72 h时间点各指标与假手术组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论ISO预处理通过上调HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表达发挥脑保护作用，但非长效作用。

异氟烷；预处理；神经保护；Bcl-2；缺氧诱导因子1α；血红素氧合酶1

研究有效措施和药物减少缺血性脑损伤是近年来医学研究的一大热点［1］。最初发现于大脑和心脏的预处理现象是可用于降低缺血性损伤的方法之一［2－3］。异氟烷（isoflurance，ISO）是临床常用的挥发性麻醉剂，可诱导新生鼠和成年鼠脑的预处理效果［4］。ISO的预处理在围手术期可降低脑卒中的发生率，在确保麻醉效果的同时最低程度影响患者脑功能。该研究通过大鼠动物模型神经功能评分、脑梗死面积测定以及相关基因包括缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血红素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）以及B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表达水平，初步揭示ISO脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组2月龄健康雄性SD大鼠购自中国医科大学实验动物部，280～300 g，随机分为假手术组、异氟烷处理组（ISO组）和单纯大脑中动脉闭塞模型组（MCAO组）。ISO组大鼠在90 min大脑中动脉闭塞MCAO建模前24 h暴露于2%ISO 30 min，操作方法参考文献［5］报道。

1.2 挥发性麻醉药预处理ISO预处理方法，通过气管插管30 min，给予实验动物吸入2%ISO进行诱导，由呼吸机控制通气，保持正常呼气末O2和CO2浓度。吸入和呼出气体有德恩红外分析仪检测（Capnomac公司，芬兰），麻醉期间肛温保持（37± 0.2）℃。

1.3 MCAO动物模型制备大鼠称重后，按3 m l／kg体重的剂量应用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉完成后，消毒颈部皮肤，颈正中切口，暴露颈总动脉、颈内及颈外动脉，将头端直径0.38 mm尼龙线栓由颈外动脉残端插入颈内动脉，操作轻柔，遇阻力即刻停止，保证线栓插入深度18～20 mm，达到阻断鼠大脑中动脉血流的目的。术中检测大鼠肛温、监测心率及平均动脉压，保证各项生理参数在正常范围，线栓1.5 h后拔出。假手术组分离血管后不插入线栓即缝合。

1.4 神经功能评分采用改良神经损伤严重程度评分（modified neurological severity score，mNSS），评分包括动物感觉、反射、运动及平衡等综合内容，1～6分：轻度损伤；7～12分：中度损伤；13～18分：重度损伤，具体评分标准见表1。

2.2 各组大鼠缺血再灌注损伤后脑梗死面积比较

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缺血性脑损伤已成为当今高致残和高致死率的神经系统疾患，发生于心脑血管手术围手术期的脑缺血影响患者术后的转归。越来越多的研究证实可吸入麻醉剂的预处理能降低缺血再灌注损伤，在一定程度上修复神经功能，但目前ISO预处理的脑保护机制尚不明确［5－6］。本研究应用SD大鼠建模后进行神经功能损伤评估，mNSS评分结果显示，ISO预处理组大鼠模型术后24 h评分明显低于单纯MCAO组，ISO组属中度损伤，单纯MCAO组mNSS评分显示达到重度损伤。TCC染色结果显示损伤后脑梗死面积对比，ISO组大鼠损伤后脑梗死面积较MCAO组明显减少，这与mNSS评分改变相一致。

2.3.2 组间各指标比较结果 在6 h和24 h时，ISO组和MCAO组HIF-1α、HO-1和Bcl-2表达水平均显著高于假手术组（P＜0.05），其中24 h时间点处ISO组3个指标表达水平均明显高于MCAO组（F＝12.171、11.450、11.136，P＜0.05）；在72 h时，3组间3个指标表达水平差异无统计学意义（F＝2.010、2.144、1.587，P＞0.05）。见图2、表2。

2.3.1 组内不同时间点比较结果 假手术组：HIF-1α、HO-1和Bcl-2表达水平在组内各时间点比较差异均无统计学意义（F＝1.470、2.204、1.811，P＞0.05）。MCAO组和ISO组：HIF-1α、HO-1和Bcl-2表达水平在24 h时间点表达显著上升，明显高于6 h时间点，差异有统计学意义（F＝15.127、17.102、20.176，P＜0.05）。见表2。

2 结果

2.1 神经功能损伤程度评估MCAO建模成功大鼠56只，建模前大鼠mNSS评分均为0分，假手术组（20只）手术未见mNSS变化评分为0分，单纯MCAO组（18只）术后24 h mNSS评分为（12.41± 3.78）分，ISO组（18只）术后mNSS评分为（9.271 ±1.94）分，组间差异有统计学意义（t＝2.136，P＜0.05）。

1.5 氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法测定脑梗死面积24 h后大鼠水合氯醛腹腔麻醉后断头取脑，自视交叉前4 mm冠状面起，向后连续切片，层厚2 mm，共取6片。切片置1%TTC染色液中，37℃避光孵育20 min，正常脑组织呈红色，梗死区脑组织呈白色。

假手术组无脑梗死发生，ISO组大鼠损伤后脑梗死面积比率为（18.24±6.47）%，较单纯MCAO组大鼠脑梗面积比率（35.18%±11.15）%明显减少（t＝2.305，P＜0.05），见图1。

2.3 大鼠脑皮层组织HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表达水平

1.2.6 序列比对 参考序列数据来自UCSC Genome Browser(http:∥genome.ucsc.edu)数据库，序列版本号：GRCh37/hg19。

1.7 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料采用表示，采用ANOVA方差分析比较组内和组间差异，t检验比较各时间点两组间的差异。

表2 HIF-1α、HO-1和Bcl-2不同时间点组间相对表达量s）

表2 HIF-1α、HO-1和Bcl-2不同时间点组间相对表达量s）

与同组6 h比较：*P＜0.05；与相同时间假手术组比较：＃P＜0.05；与相同时间MCAO组比较：△P＜0.05

项目假手术组MCAO组ISO组HIF-1α 6 h 0.22±0.09 0.35±0.12＃0.56±0.17△＃24 h 0.31±0.11 0.53±0.25*＃0.92±0.37*△＃72 h 0.27±0.08 0.30±0.11 0.30±0.12 HO-1 6 h 0.24±0.09 0.38±0.14＃0.59±0.08△＃24 h 0.25±0.10 0.68±0.29*＃0.96±0.37*△＃72 h 0.26±0.13 0.33±0.15 0.34±0.11 Bcl-2 6 h 0.30±0.09 0.43±0.13＃0.60±0.21△＃24 h 0.33±0.10 0.74±0.32*＃1.01±0.39*△＃72 h 0.35±0.12 0.38±0.14 0.34±0.13

3 讨论

1.6 Westernblot检测蛋白表达取梗死侧脑组织，裂解，离心提取总蛋白，BCA法定量，取20μg样本，上样于SDS-PAGE凝胶，电泳结束后半干转法转印蛋白至NC膜，5%脱脂奶粉4℃封闭2 h，一抗孵育过夜，洗膜后二抗孵育，洗膜后ECL发光。采用Image J凝胶图像处理系统计算目的条带与相应内参β-actin平均灰度值，根据目的条带与内参的灰度比值得出目的蛋白相对表达量。

实验室是以专业为基础，依托教研室建立起来的，实验教学、实验室人员主要由教研室管理。在这种体制下，各教研室各自为政，实验室建设缺乏整体和全局意识，管理分散，实验室建设力求小而全，使得实验设备、仪器仪表、工具等重复购置。又由于仪器维修管理制度不全，导致仪器设备维修困难，进度缓慢，也造成了仪器设备共享障碍。

HIF-1α通过调节其靶基因如HO-1的表达在细胞存活、糖代谢以及代谢适应中发挥作用［7－8］。研究［9］表明，七氟烷处理能介导HIF-1α上调，达到减少缺血后心血管损伤。转基因小鼠神经元中HO-1过表达在脑缺血损伤过程中发挥脑保护功能，HO-1通过自适应机制发挥作用。HO-1可能通过调节胞内强效抗氧化胆色素发挥神经保护功能，而HO-1潜在重要产物CO可促进微血管内皮细胞形成。本研究显示，经ISO预处理组动物模型HIF-1α和HO-1蛋白表达水平均呈现上调，在6 h时间点，ISO组与单纯MCAO组表现出差异，24 h时差异达到最大，至72 h组间无明显差异。此结果提示ISO的预处理针对HIF-1α和HO-1蛋白表达的脑保护功能具有时效性，属短时作用。

此外，预处理诱导神经保护蛋白的激活作用可发生在预处理后的几小时或几天时间，而Bcl-2是被广泛认可的抗凋亡蛋白，其可改善新生大鼠的神经功能，在体外研究中同样具有神经保护功能［10－11］。本研究结果显示，ISO的预处理可增加Bcl-2的表达水平，ISO组与单纯MCAO组差异具有显著性，同样在24 h到达峰值。ISO的预处理增加Bcl-2表达，通过减缓细胞凋亡进程达到神经保护的作用。

由于认识不足，湿地往往被人们作为荒地、荒水、荒草看待，不重视湿地生态保护和生态旅游开发。政府需要加强湿地生态教育，通过各种形式，增强人们湿地旅游意识，使人们养成爱湿地、护湿地、用湿地的好风气。

综上所述，经异氟烷预处理后，大鼠神经功能评分显著降低，损伤程度更小，脑梗死面积明显缩小；脑组织HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表达水平显著上调，24 h达到最高值。可见，异氟烷预处理能降低MCAO大鼠缺血再灌注损伤，具有脑保护功能。

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Cerebral protective effect of isoflurance preconditioning for adult ratmodel w ith local cerebral ischem ia

Qiu Yan1，Dong Bin2，Cai Xiaolan1
（1Dept of Anesthesiology，2Dept of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital to Dalian Medical University，Dalian 116011）

Objective To investigate the brain protective effects of isoflurane preconditioning for local cerebral ischemia adult ratmodel by detecting HIF-1α，HO-1 and Bcl-2 expression level.Methods84 two-month old Sprague-Dawley male rats were randomly divided into sham group，ischemia-reperfusion group（MCAO group）and isoflurance preconditioning group（ISO group）.ISO group was exposed to isoflurane for 30 min and then underwent a 90 min middle cerebral arterial occlusion（MCAO），while MCAO group underwent MCAO only.At 24 h after reperfusion all the groups were investigated by modified neurological severity score for neurological deficits，TTC staining for infarct percentage.Cerebral cortices were harvested for HIF-1α，HO-1 and Bcl-2 protein expression level detection at 6 h，24 h and 72 h after reperfusion using RT-PCR and western blot.ResultsThemNSS score and infarct percentage in ISO group decreased significantly compared with those ofMCAO group at24 h after reperfusion（P＜0.05）.Compared with the MCAO group，ISO group had significantly up-regulated protein levels of HIF-1α，HO-1 and Bcl-2 at6 h and 24 h after reperfusion（P＜0.05）.There was no difference between ISO group and MCAO group for 3 gene expression at 72 h（P＞0.05）.ConclusionIsoflurane preconditioning plays shortterm cerebral protective effect through the up regulation of HIF-1α，HO-1 and Bcl-2 gene expression.

isoflurane；preconditioning；cerebral protection；Bcl-2；HIF-1α；HO-1

R 971.2

A

1000－1492（2015）08－1099－04

2015－03－24接收

国家自然科学基金（编号：81371454）

大连医科大学附属第一医院1麻醉科、2神经外科，大连116011

邱 焱，女，硕士研究生；

蔡晓岚，女，主治医师，责任作者，E-mail：xiaolancai＠126. com