外周血间充质干细胞凝胶对兔肌腱移植物重建前交叉韧带腱骨愈合的影响

刘家能，徐 斌，徐洪港，朱雪坤，陈鹏

外周血间充质干细胞凝胶对兔肌腱移植物重建前交叉韧带腱骨愈合的影响

刘家能，徐 斌，徐洪港，朱雪坤，陈鹏

目的探讨在兔自体肌腱移植物重建前交叉韧带（ACL）模型股骨道内注入自体外周血间充质干细胞（PBMSCs）凝胶对早期腱骨愈合的影响。方法健康3～4月龄新西兰大白兔32只，随机均分为PBMSCs组与对照组，PBMSCs组予以皮下注射粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员6 d后采集外周血，采用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化PBMSCs，光镜下观察细胞形态并行流式细胞术检测鉴定表面抗原表达。建立自体肌腱移植物重建前交叉韧带模型，PBMSCs组于动物模型股骨道内注入PBMSCs凝胶，对照组仅注入凝胶。分别于术后第2、4、8、12周每组随机取4只处死取材，1只做Masson三色染色观察组织愈合的病理表现，3只做股骨道移植物抗牵拉试验观察其愈合强度。结果流式细胞术检测结果提示PBMSCs表面表达CD29、CD90，不表达CD11b、CD34。Masson三色染色显示PBMSCs组术后第4周胶原纤维开始增生，排列紊乱，第8周胶原纤维显著增生，排列不规则，第12周胶原纤维大量增生，排列有序。PBMSCs组腱骨愈合速度较对照组迅速。PBMSCs组和对照组的股骨道移植物抗牵拉强度随时间延长呈现上升趋势，其中PBMSCs组移植物的抗牵拉强度自第8周起明显高于对照组（P＜0.01）。结论PBMSCs凝胶对兔自体肌腱移植物重建ACL的早期腱骨愈合有促进作用。

前交叉韧带；腱骨愈合；外周血间充质干细胞

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是维系膝关节稳定的重要弹性结构，但是在损伤或断裂后无法引起血小板聚集，不能激活凝血系统，难以自愈［1］，会导致膝关节稳定性降低，加大膝关节内软骨和半月板等其他结构损伤的风险，目前公认有效的治疗方法是进行关节镜下肌腱移植物重建ACL手术［2］。肌腱移植物在骨道内的愈合，即腱骨愈合的强度决定了术后移植物的稳定性，对指导术后功能锻炼、患肢负重以及参加体育活动起到关键性作用，是保证ACL重建术临床效果的重要因素。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的一类多潜能干细胞，其主要存在于结缔组织与器官间质中，如骨髓、脂肪、羊膜组织、脐带、外周血等。MSCs具有强大的增殖能力、多向分化潜能和免疫调节功能，在适宜的体内或体外环境下可以向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、骨髓基质细胞、血管内皮细胞及神经细胞样细胞分化，并且多次传代扩增后仍具有干细胞特性，是重要的组织工程种子细胞［3］。该实验建立兔自体肌腱移植物重建ACL模型，加入外周血间充质干细胞（peripheral blood mesenchymal stem cells，PBMSCs）作为影响因素，探讨PBMSCs对早期腱骨愈合有无促进作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组3～4月龄健康新西兰大白兔32只，不限雌雄，体重2.3～2.7 kg，清洁级，购自安徽医科大学实验动物中心。根据实验要求随机均分为PBMSCs组和对照组。术前白兔运动饮食正常，体检未发现膝关节周围肿胀，四足均无溃烂，双膝前抽屉实验、Lachman实验均为阴性。抛硬币法随机选取一侧膝关节，建立自体肌腱移植物重建ACL模型，PBMSCs组于模型股骨隧道内注入PBMSCs凝胶，对照组仅注入凝胶。

1.2 主要试剂与仪器粒细胞集落刺激因子（北京双鹭药业股份有限公司）；Percoll分离液（美国Pharmaeia公司）；10%胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；细胞培养时用的青霉素－链霉素、胰酶细胞消化液（上海碧云天生物技术有限公司）；LDMEM液、牛血清白蛋白（美国Hyclone公司）；抗兔CD11b、CD29、CD34、CD90抗体（美国Santa Cruz公司）；凝血酶冻干粉（长春国奥药业有限公司）；人纤维蛋白原（上海莱士血液制品股份有限公司）；Masson三色染色试剂盒（福州迈新生物科技有限公司）。CO2培养箱（上海姚氏仪器设备厂）；BHC-1300ⅡA生物安全柜（苏州净化设备有限公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；EpicsXL型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；FA1204B电子分析天平（上海精科天美贸易有限公司）；NK100指针式拉力计（上海艾固检测仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 提取、培养PBMSCs PBMSCs组动物按照30μg／（kg·d）剂量予以粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）动员6 d，第7天经耳缘静脉采集外周血15 ml，在无菌工作台内按照1∶1比例与磷酸盐缓冲液（PBS）稀释混合，吹打均匀，缓慢加入密度为1.073 g／L的Percoll分离液，以此为离心介质分离细胞（2 500 r／min，20 min），吸取灰白色云雾状的白膜层（单个核细胞层），适量PBS洗涤后加入含有10%胎牛血清、100 U／m l青霉素和100 U／ml链霉素的L-DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2、80%湿度的培养箱中培养。3 d后半量换液，5 d后全量换液，以后每3～4 d换液1次，倒置相差显微镜下观察传代细胞以集落方式贴壁生长，呈长梭型或多角形。当贴壁生长的原代细胞呈80%～90%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化3 min，按照1∶2比例进行传代。

1.3.2 流式细胞仪检测PBMSCs细胞表面抗原表达 胰蛋白酶消化第3代贴壁细胞，收集细胞悬液，常温下800 r／min离心5 min，弃去上清液，PBS（含1%牛血清白蛋白）清洗细胞3次，计数细胞以达到流式细胞仪检测的细胞数量要求，每管含细胞数1.0×105个，向各管内依次加入CD11b、CD29、CD34、CD90抗体，避光、孵育35 min，之后以PBS（含1%牛血清白蛋白）清洗细胞，去除未结合抗体，以500μl PBS重悬细胞并转入流式管中，流式细胞仪测定相应CD分子标记率。

1.3.3 制备PBMSCs凝胶混合物 消化收集第3代PBMSCs 1.0×105个，以0.3 ml PBS冲洗形成细胞悬液，同时取凝血酶冻干粉0.1 g、人纤维蛋白原0.1 g与2 ml氯化钙注射液混合，1 m l注射器抽取0.3 ml混合液与0.3 m l细胞悬液，摇匀混合，25～30 s（室温24℃）即可形成凝胶。

1.3.4 建立兔ACL重建实验模型 3%戊巴比妥纳溶液按照1 m l／kg剂量经耳缘静脉缓慢静推，完全麻醉后单侧膝关节备皮，碘酒、酒精消毒，无菌手术巾铺巾覆盖。做小腿后方纵行切口，分离并离断合适长度的趾长屈肌腱，对折肌腱，游离端使用4-0无菌缝合线编织缝合，对折端用1.0 mm钢丝穿过，无菌生理盐水纱布覆盖待移植肌腱备用。做髌旁内侧入路，以髌骨为中心，切开内侧支持带，将髌骨推向外侧，充分暴露兔膝关节腔，辨别并剪断ACL，检查前抽屉试验及Lachman实验（＋），建立ACL断裂模型，屈曲兔膝关节于90°位置，沿原ACL走形方向及上下止点附丽处，使用2.5 mm克氏针建立胫骨道与股骨道，1.0 mm克氏针于股骨髁上方约2 mm处建立两处骨道，自胫骨端向股骨端引入移植肌腱，股骨端两段钢丝均由外向内穿过骨道，于内侧相交并拧紧，PBMSCs组与对照组分别将PBMSCs凝胶或凝胶均匀注入股骨隧道，将胫骨端肌腱拉紧并与周围骨膜、筋膜等组织缝合固定。复位髌骨，检查前抽屉试验及Lachman试验（－），无菌生理盐水冲洗关节腔，逐层缝合手术切口，无菌敷料包扎伤口。待麻醉苏醒后送回安徽医科大学实验动物中心笼内饲养，自由活动，每日检查实验动物的手术伤口及一般情况。其中PBMSCs组1只实验动物于术后当日死亡，对照组2只实验动物分别于术后第3天和第4天死亡，均立即补齐；PBMSCs组与对照组分别有3只和2只实验动物于术后1～3 d内出现手术切口红肿、脓性渗出等症状，予以每日20万U青霉素钠肌注3 d后均症状好转，其余实验动物均未发生感染且存活至标本取材阶段。

1.3.5 标本制备 术后第2、4、8、12周使用空气栓塞法每组各处死4只实验动物，立即手术取出实验膝关节，剔除多余软组织，1只用于Masson三色染色，3只用于股骨端移植物抗牵拉力试验。Masson染色观察标本仅留取股骨端（股骨干下1／3与股骨髁），固定于10%中性福尔马林溶液中72 h，取出标本，10%EDTA磷酸缓冲液脱钙4～6周。移植物抗牵拉试验标本留取股骨端（股骨下1／2）、移植ACL、胫骨端（胫骨上1／2），即刻进行试验。

1.3.6 Masson三色染色 针刺法判断组织脱钙满意后，沿移植物纵轴切开标本，按照脱水、透明、包埋程序制成蜡块，切成5μm厚薄片，置于载玻片上脱蜡至水，滴加100μl Masson复合染色液染色5 min，蒸馏水冲洗；滴加100μl磷钼酸染色5 min，甩干；滴加100μl苯胺蓝染色5 min，蒸馏水稍冲；滴加100μl分化液分化30～60 s（重复1次），脱水、透明、封片后置于光学显微镜下观察。

1.3.7 股骨道移植物抗牵拉强度试验 调整室温至24℃，湿度70%，抽出用于固定股骨端肌腱的钢丝，生理盐水滴浴标本，标本股骨端以三段钢丝捆扎固定于测试架上方水平支架上，胫骨末端打孔予以穿过钢丝并固定在测试架下方卡口处，裁剪合适大小铝板肤贴固定于胫骨结节后方，并钢丝捆扎，另一端连接拉力计，于水平位置均匀用力牵拉胫骨端钢丝（图1），直至移植物自股骨道内脱出，记录拉力计峰值数据。

1.4 统计学处理采用SPSS 18.0统计软件进行分析，详细记录两组移植物肌腱自骨道内脱出时所需拉力的大小，结果用±s表示，两组间采用两样本t检验。

2 结果

2.1 PBMSCs表面标志物的表达流式细胞仪检测结果提示：本实验中所培养的第3代PBMSCs均一表达CD29、CD90，阳性表达率为97.3%、98.4%，而CD11b、CD34呈阴性，阳性表达率为1.3%、1.3%，见图2。

2.2 Masson三色染色观察术后2周：两组在腱骨交界处均有大量坏死组织形成，纤维排列紊乱，成纤维细胞与胶原纤维均无明显增生，见图3A。

术后4周：对照组仍有大量坏死组织，纤维排列不齐，有少量成纤维细胞增生，但未见明显胶原纤维。PBMSCs组坏死组织较对照组减少，组织排列欠规则，有少量成纤维细胞及胶原纤维长入，见图3B。

术后8周：对照组有大量成纤维细胞长入，纤维排列欠规则，腱骨愈合界面有少量胶原纤维长入。PBMSCs组有大量成纤维细胞长入，部分纤维排列整齐，部分欠规则，腱骨愈合界面有大量胶原纤维长入，见图3C。

术后12周：对照组成纤维细胞数量减少，胶原纤维生成增多，腱骨愈合交界处成纤维细胞与胶原纤维数量比约为1∶1。PBMSCs组仅残余少量成纤维细胞，大量胶原纤维规则排列在腱骨愈合交界处，见图3D。

2.3 股骨道移植物抗牵拉强度股骨道移植物抗牵拉力强度随时间延长呈上升趋势，第2周、第4周时，两组之间抗牵拉力强度差异无统计学意义。术后第8周及第12周，PBMSCs组抗牵拉力强度明显大于对照组（P＜0.01），见表1。

表1 术后各时间段两组股骨道移植物抗牵拉强度对比（N，±s）

表1 术后各时间段两组股骨道移植物抗牵拉强度对比（N，±s）

项目对照组（n＝3）PBMSCs组（n＝3）t值P值术后2周22.87±3.91 24.93±1.94－0.820 0.456术后4周38.60±3.41 39.67±4.82－0.313 0.770术后8周50.73±2.32 61.07±3.00－4.725 0.009术后12周65.87±4.31 89.80±5.70－5.817 0.004

3 讨论

ACL重建手术在骨道内建立了一个全新的腱－骨交界面，而移植肌腱与骨道在这个界面上的修复重建却是一个缓慢而复杂的生物过程，目前已经有大量的动物试验及临床试验对腱骨愈合过程进行了深入的研究。在关节镜下ACL重建手术及术后康复过程中影响腱骨愈合的因素有很多，如：移植物材料、骨道定位、骨道内移植物长度和直径、移植物的固定方式、移植物在骨道内的张力、移植物在骨道内的移动以及早期康复锻炼等［4］。在组织学方面，腱骨愈合经历3个阶段：①组织炎症期；②血管长入与细胞增生期；③韧带重建期，各阶段间无明显组织学与时间界限，约在第8周起，纤维瘢痕开始形成［5］。在ACL重建过程中，腱骨愈合是最薄弱的环节，也是决定手术成败的关键所在，如何促进肌腱移植物在骨道内的愈合或加强愈合强度成为当前运动医学领域的研究热点。

Bietal［6］报道术后规律皮下注射甲状旁腺激素［1－34］对大鼠ACL重建模型早期腱骨愈合有促进作用。Kuang et al［7］使用涂有掺锶磷灰石骨水泥的同种异体腱重建兔ACL，术后组织学提示实验组较对照组提早完成了腱骨愈合。Gulotta et al［8］认为肿瘤坏死因子α拮抗剂可以加强大鼠肩袖修补术后早期腱骨愈合的生物力学强度。Kovacevic et al［9］在大鼠冈上肌肌腱断裂模型中使用rhPDGF-BB涂层补片修补冈上肌，较普通补片能增加腱骨愈合早期的细胞增生和血管再生。上述实验均取得了一定的成果，也为后期的临床试验打下了坚实的基础。

由于MSCs具有多向分化与无限增殖的特性，使其在运动医学修复重建领域具有广阔的临床应用前景，目前国内外学者更多的把研究方向指向了骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，bMSCs）［10］。Li et al［11］使用超顺磁纳米铁颗粒和细胞膜红色荧光探针标记bMSCs，与生物蛋白胶混合后注入兔ACL重建模型的膝关节中，认为bMSCs可以促进早期腱骨愈合。但是骨髓移植治疗在临床上的使用存在来源有限、取材属于有创操作且存在感染风险等问题，MSCs的同源性让研究者把目光转向其他来源。Toghraie et al［12］从髌下脂肪垫中提取脂肪来源MSCs治疗膝关节软骨缺损和骨性关节炎，取得了理想的效果。Sekiya et al［13］发现膝骨关节炎患者关节液中MSCs细胞数量较正常人增加，并证明这些MSCs来自滑膜而非骨髓。Zhao et al［14］首先在动员后的外周血中提取，培养出具有多能干细胞潜能的一类细胞，即PBMSCs，随着研究的深入，PBMSCs的提取与培养鉴定已经日趋成熟。

本研究对提取培养出的细胞行流式细胞仪检测细胞表面抗原表达，结果提示CD29、CD90呈阳性，CD11b、CD34呈阴性，符合MSCs鉴定标准［15］。成功移植入兔ACL重建模型股骨端后在不同时间段对腱骨愈合的组织学特征和抗牵拉强度进行观察，评估PBMSCs对腱骨愈合的影响。术后第2周和第4周，PBMSCs组与对照组在组织学特征和抗牵拉强度上均无明显区别，自第8周开始，PBMSCs组腱骨愈合界面胶原纤维数量较对照组明显增多，抗牵拉强度亦显著大于对照组。可见PBMSCs在这个时间段可以促进腱骨界面胶原纤维形成，从而加强生物力学强度。

ACL重建后的腱骨愈合重建过程极其复杂，其愈合类型和方式，以及可以对其愈合造成影响的因素都有待于进一步研究，PBMSCs因取材微创、感染率低，有利于实现临床自体细胞移植的目标，有着广阔的临床应用前景。本研究结果表明：PBMSCs可以促进ACL重建术后的早期腱骨愈合，加强腱骨愈合生物力学强度，为临床促进腱骨愈合提出了一种新的思路。

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The tendon-to-bone healing of ACL reconstruction in a rabbitmodel using autograft seeded w ith PBMSCs gel

Liu Jianeng，Xu Bin，Xu Honggang，et al
（Dept of Sports Injury and Arthroscopic Surgery，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective This study was conducted to analyze the effect of peripheral blood mesenchymal stem cells（PBMSCs）gel on the early period of tendon-to-bone healing after reconstruction of the anterior cruciate ligament（ACL）using autograft.MethodsThirty-two New Zealand rabbits aged 3～4 months were randomly divided into two groups（n＝16 per group）：experimentaland control.After rabbits from the experimentalgroup weremobilized by subcutaneous injection of granulocyte colony stimulating factor（G-CSF）for 6d，the PBMSCs were isolated from rabbit peripheral blood samples by combination of density gradient centrifugation and adhesive culture，morphology of cell proliferation was observed by microscopy and phenotypes of PBMSCs were detected by flow cytometry.A model of ACL reconstruction using autograftwas performed in all of the rabbits，the experimental group received injection of PBMSCs gel into the femur tunnel and the control group received gel only.At 2，4，8 and 12 weeks，4 animals in each group were euthanized，1 for histologic assessment by Masson trichrome staining and 3 for biomechanical testing.ResultsFlow cytometry showed that the PBMSCs expressed CD29，CD90 positive，CD11b，CD34 negative.According to the Masson trichrome staining，in the experimental group，collagen fiberswere presented but had a disordered arrangement at4 weeks after surgery.At8 weeks after surgery，collagen fiberswere obviously increased but irregularly arranged.At12 weeksafter surgery，collagen fiberswere formed in abundance and regularly arranged.The healing at tendon-bone interface of the experimental group was quicker than those of the control group.Themaximum biomechanical pull-out strength of the autograft in the femur tunnel presented a rising trend with the prolong of repair time in both experimental and control groups，and itwas significantly higher in the experimental group at8 and 12 weeksafter surgery（P＜0.01）.ConclusionPBMSCs gel could enhance the early period of tendon-to-bone healing after reconstruction of the ACL using autograft.

anterior cruciate ligament；tendon-to-bone healing；peripheral blood mesenchymal stem cells

R 686.5

A

1000－1492（2015）08－1081－05

2015－04－23接收

安徽省自然科学基金（编号：1208085MH157）

安徽医科大学第一附属医院运动创伤与关节镜外科，合肥230032

刘家能，男，硕士研究生；

徐 斌，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：youchen100＠126.com