胶质瘤组织和细胞系中Nanog基因启动子区甲基化检测

汪 炎，牛朝诗，3，李仲颖，杨 洋，贺 虎，程传东，李 静

胶质瘤组织和细胞系中Nanog基因启动子区甲基化检测

汪 炎1，2，牛朝诗1，2，3，李仲颖1，2，杨 洋1，2，贺 虎1，2，程传东1，2，李 静1，2

目的检测胶质瘤组织和细胞系中Nanog基因启动子区甲基化状态与Nanog基因的表达，并探讨其在胶质瘤发展中的作用。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）法分别检测正常脑组织、胶质瘤组织、胶质瘤癌旁组织、胶质瘤细胞系U87和U251中Nanog基因启动子区甲基化状态，实时定量PCR（RT-PCR）法检测相应组织和细胞系中Nanog表达情况。结果MSP法检测胶质瘤组织Nanog基因启动子区呈非甲基化状态，且非甲基化检出率（58.82%）高于癌旁组织（13.63%），差异有统计学意义（χ2＝14.852，P＜0.01）。对MSP法检测结果行灰度值分析，高级别胶质瘤中Nanog基因启动子区非甲基化程度高于低级别组。U87和U251细胞系中Nanog基因启动子区呈非甲基化状态。RT-PCR结果显示高级别胶质瘤中Nanog mRNA相对表达量高于低级别组，U87和U251细胞系中NanogmRNA的转录明显增多。结论胶质瘤中Nanog基因启动子区呈非甲基化状态，且可能促进Nanog基因的转录，影响胶质瘤的发生与发展。

胶质瘤；Nanog；DNA甲基化

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，复发率及死亡率高，其发病机制至今尚不明确，探索其发病机制，寻找有效的治疗措施，一直是神经外科的研究重点。Nanog基因是维持胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）自我更新和亚全能性的关键因子，在胶质瘤组织和胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs）中皆呈阳性表达，促进着胶质瘤的恶性生物学行为［1－3］。基因启动子区CpG岛的非甲基化状态是癌基因激活的一种重要机制。已有研究［4］表明在生殖细胞肿瘤中，Nanog基因启动子区CpG岛呈非甲基化状态促进Nanog的转录，维持着肿瘤细胞未分化的特性。该研究探讨人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中Nanog启动子区甲基化状态与Nanog基因表达的关系，为研究胶质瘤的发生与发展提供可能的分子依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源选用安徽医科大学附属省立医院神经外科2012年2月～11月手术切除胶质瘤标本51例和相应癌旁组织22例。51例胶质瘤标本术后经病理检查确诊，根据WHO 2007中枢神经系统肿瘤分类标准进行分级：Ⅰ级7例，Ⅱ级10例，Ⅲ级16例，Ⅳ级18例。正常脑组织标本12例取自颅脑损伤行内减压术的病患，术后病理检查证实均为正常脑组织，无胶质细胞增生和坏死。标本取得后于10 min内置入－80℃冰箱中冷冻保存。

1.2 细胞系与主要试剂人脑胶质瘤细胞系U87、U251（中国科学院上海细胞所）。细胞培养液DMEM／F12、进口胎牛血清及胰蛋白酶（美国Gibco公司）；DNA提取试剂盒（中国天根公司）；EZ DNA Methylation Kit（美国ZYMO RESEARCH公司）；Oligod（T）18、Ex Taq DNA聚合酶、Marker D2000、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ实时定量试剂盒、Prime-Script RT-PCR Kit、Nanog和GAPDH Real-time PCR引物设计合成（日本TaKaRa公司）；Nanog甲基化和非甲基化引物合成由上海生工生物公司完成；其他常规试剂为进口或国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 人脑胶质瘤细胞系U87、U251置于10%胎牛血清、100 U／m L青霉素／链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养，常规传代。

1.3.2 甲基化特异性聚合酶链式反应（methylationspecific polymerase chain reaction，MSP）

1.3.2.1 DNA提取 使用DNA提取试剂盒，按照说明书操作，分别从胶质瘤组织、癌旁组织、正常脑组织及细胞中提取基因组DNA。使用酶标仪（瑞士TECAN Infinite200）测定提取DNA样本的纯度和浓度。

1.3.2.2 DNA甲基化修饰 每份标本取5μg DNA作为模板，加ddH2O至20μl。使用EZ DNAMethylation Kit试剂盒，对样本进行亚硫酸盐处理并纯化，甲基化修饰后的DNA保存于－20℃备用。

1.3.2.3 PCR扩增 以甲基化修饰后的DNA为模板，分别用Nanog基因启动子区特异甲基化和非甲基化引物行PCR扩增反应，ddH2O替代DNA样本作为阴性对照。引物设计参考文献［5］，其中甲基化引物序列：5′-TTAATTTATTGGGATTATAGGGGTG-3′（上游），5′-AAACCTAAAAACAAACCCAACAAC-3′（下游），非甲基化引物序列：5′-ACTGTCTCTCCTCTTCCCTC-3′（上游），5′-CCTGTTTGTAGCTGAGGTTC-3′（下游）。PCR反应体系（10μl）：cDNA模板1 μl，上下游引物各0.5μl，Ex Taq DNA聚合酶5μl，ddH2O 3μl。反应条件：94℃预变性10 min后，94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10 min。取PCR产物10μl置于1.5%琼脂糖凝胶上电泳，采用BIO-RAD凝胶成像系统进行凝胶成像，Quantity One软件行灰度值分析。

1.3.3 Real-time PCR检测Nanog表达 TRIzol-氯仿-异丙醇法提取胶质瘤组织和细胞系中的总RNA。按照反转录试剂盒说明书将提取的总RNA反转录成cDNA。在美国ABI Prism 7500快速实时定量PCR仪上进行Real-time PCR反应，条件：95℃预变性30 s后，95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，共35个循环。反应体系（20μl）：cDNA模板2μl，上下游引物各0.8μl，SYBR Premix EX TaqTMⅡ（2×）10 μl，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μl，ddH2O 6 μl。所有样品设3个复孔。记录每个反应管中的荧光信号达到阈值所经历的循环数Ct值，以GAPDH为内参，得到Nanog的相对表达量。Nanog上游引物：5′-CCTGTGATTTGTGGGCCTGA-3′，下游引物：5′-CTCTGCAGAAGTGGGTTGTTTG-3′，片段大小为168 bp。GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，片段大小为138 bp。PCR结果判断：ΔCt＝Ct目的基因－Ct内参，ΔΔCt＝（Ctnanog－Ctgapdh）高级别－（Ctnanog－Ctgapdh）低级别，RQnanog＝2－ΔΔCt［6］。

1.4 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据以±s表示。计数资料采用χ2检验，计量资料采用两独立样本t检验。

2 结果

2.1 胶质瘤组织中Nanog基因启动子区甲基化状态Nanog基因启动子区甲基化引物和非甲基化引物扩增片段长度分别为213 bp和225 bp。51例胶质瘤标本中，30例标本检测出Nanog基因启动子区呈非甲基化状态，而22例癌旁组织中仅有3例检测出非甲基化，两者差异有统计学意义（χ2＝14.852，P＝0.000）。正常脑组织中未检测出非甲基化的表现。Nanog启动子区非甲基化率在胶质瘤WHOⅠ级、WHOⅡ级、WHOⅢ级、WHOⅣ级标本中分别为42.9%（3／7）、50.0%（5／10）、62.5%（10／16）、66.7%（12／18），各病理级别之间差异无统计学意义（χ2＝1.605，P＝0.658）。对目的条带行灰度值分析，Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤的灰度值明显高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤（t＝6.988，P＝0.000）。Nanog启动子区非甲基化程度随着胶质瘤病理级别的增加而升高。见图1。

2.2 胶质瘤组织中Nanog启动子甲基化和其mRNA表达的关系Nanog和GAPDH扩增产物的溶解曲线显示均为单峰，表明扩增产物单一，无非特异性扩增；扩增曲线显示Nanog呈指数增长，并进入平台期，表明扩增效率高。见图2、3。Nanog启动子区非甲基化阳性的30例标本中检测出28例发生Nanog的转录，而未发生非甲基化的21例中有15例检测出Nanog的转录，两者差异有统计学意义（χ2＝4.482，P＝0.034）。癌旁组织和正常脑组织中均未检测出Nanog的表达。以GAPDH为内参、低级别中Nanog表达量为基准，低级别和高级别胶质瘤中Nanog的相对表达量分别为（1.24±0.61）、（4.53± 0.91），高级别胶质瘤Nanog表达相对于低级别胶质瘤明显升高（t＝11.41，P＝0.00）。见图4。

2.3 胶质瘤细胞系中Nanog启动子甲基化和其mRNA表达的关系MSP法检测显示U87、U251细胞系中Nanog启动子区非甲基化引物扩增出目的条带，而甲基化引物未扩增出条带。说明U87、U251细胞系中Nanog启动子区呈非甲基化状态。Realtime PCR结果显示，在U87、U251细胞系中发生了Nanog基因的转录。见图5。

3 讨论

Nanog是近年来在ESCs内发现的一个重要转录因子，该因子对维持ESCs的自我更新及亚全能性起着关键作用，是全能性或多能性干细胞标志物［6］。本课题组前期研究［1－3］显示，Nanog在胶质瘤中高表达并随着病理级别的增高其表达增多；在GSCs中Nanog亦呈高表达，且显著高于U87胶质瘤细胞系，表明Nanog是一种与分化紧密相关的重要调节因子，并作为候选癌基因调节胶质瘤的生物学行为。

肿瘤是由于表观遗传和遗传异常共同作用，导致基因表达失调而发生的。表观遗传学包括组蛋白修饰、RNA干扰、DNA甲基化、染色质重塑等，精确调控着基因表达，而不改变基因的序列［7］。基因启动子区CpG岛的呈现出非甲基化状态是激活癌基因的一种重要机制。Nanog启动子区散在分布着组织依赖差异的DNA甲基化区域（T-DMR）。T-DMR在ESCs中非甲基化，使Nanog得以表达，而在滋养层干细胞（trophoblast stem cells，TSCs）中呈高甲基化，使Nanog表达失活［8］。在胚胎癌细胞中Nanog启动子区CpG位点未发生DNA甲基化，而在293T细胞中有67%甲基化，将293T用胚胎癌提取物处理4周后，甲基化的CpG位点下降到39%［9］。Nettersheim et al［4］发现在生殖细胞肿瘤中OCT4与SOX2介导的Nanog表达可以被Nanog启动子区CpG岛的高甲基化所沉默，并且发现生殖细胞肿瘤的分化状态与Nanog启动子区CpG岛的甲基化程度密切关联。

本研究显示，脑胶质瘤中Nanog启动子区非甲基化率明显高于癌旁组织和正常脑组织，表明Nanog启动子区非甲基化在胶质瘤中是一个频发事件且有着显著的肿瘤特异性。非甲基化阳性组中NanogmRNA的表达明显高于阴性组，高级别胶质瘤中Nanog启动子区非甲基化程度高于低级别组，NanogmRNA的转录水平亦明显升高，前期的免疫组化和Western blot结果显示，Nanog的蛋白表达强度随着胶质瘤组织的病理级别的升高而增强，提示Nanog启动子区非甲基化是导致Nanog蛋白表达增强的重要机制［1］。Nanog启动子区在U87、U251细胞系中皆呈非甲基化状态，且在U87、U251细胞系亦检测到Nanog基因的转录，进一步证明Nanog启动子区非甲基化状态促进Nanog的表达，维持肿瘤细胞的低分化或未分化状态。

本实验中扩增的Nanog启动子区片段是位于其转录起始位点上游－200 bp区域，此区域中包含着与转录因子Oct4／Sox2的结合位点（－104 bp～－108 bp）［7］，对Nanog的调控起着重要作用。有研究者利用电泳迁移变动分析和染色质免疫共沉淀实验证明，Oct4和Sox2确实能在体外和体内结合到Nanog的启动子上［18］。对该位点进一步的诱变分析表明，Oct4／Sox2对于Nanog启动子活性是必不可少的，并能在多能性细胞中提高Nanog的转录。结合本研究结果，在胶质瘤中该区域的CpG岛呈非甲基化状态，更有利于Oct4、Sox2与Nanog启动子区的结合，促进Nanog的表达。

综上所述，人脑胶质瘤中Nanog基因启动子区非甲基化模式与Nanog的表达有着密切的相关性。通过改变胶质瘤中Nanog启动子区原有甲基化模式，是否能够下调Nanog的表达从而抑制胶质瘤细胞的恶性生物学活性还有待进一步研究。

［1］ Niu C S，Li D X，Liu Y H，et al.Expression of NANOG in human gliomasand its relationship with undifferentiated glioma cells［J］. Oncol Rep，2011，26（3）：593－601.

［2］ 李冬雪，牛朝诗，刘于海，等.Nanog基因在脑肿瘤干细胞中的表达及其意义［J］.中华神经外科杂志，2011，27（2）：125－30.

［3］ 李冬雪，牛朝诗，刘于海，等.胶质瘤组织中Nanog基因的表达及其意义［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2010，8（6）：504－8.

［4］ Nettersheim D，Biermann K，Gillis A J，et al.NANOG promoter methylation and expression correlation during normalandmalignant human germ cell development［J］.Epigenetics，2011，6（1）：114－22.

［5］ Deb-Rinker P，Ly D，Jezierski A，et al.Sequential DNA methylation of the Nanog and Oct-4 upstream regions in human NT2 cells during neuronal differentiation［J］.JBiol Chem，2005，280（8）：6257－60.

［6］ Silva J，Nichols J，Theunissen TW，et al.Nanog is the gateway to the pluripotent ground state［J］.Cell，2009，138（4）：722－37.

［7］ Jones PA，Baylin SB.The epigenomics of cancer［J］.Cell，2007，128（4）：683－92.

［8］ Hattori N，Imao Y，Nishino K，et al.Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells［J］.Genes Cells，2007，12（3）：387－96.

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Analysis and significance of Nanog promoter methylation status in gliomas and gliom a cells

Wang Yan1，2，Niu Chaoshi1，2，3，Li Zhongying1，2，et al
（1Dept of Neurosurgery，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001；2Anhui Province Key Laboratory of Brain Function and Brain Disease，Hefei 230001；3Anhui Provincial Stereotactic Neurosurgical Institute，Hefei 230001）

Objective To detect themethylation status of Nanog gene promoter and the expression of NanogmRNA in gliomas and glioma cell lines，and to explore the function of Nanog in glioma.MethodsMSP and RT-PCR were conducted to detect Nanog gene promoter′smethylation statusand itsmRNA expression in normal brain tissues，glioma tissues，paracancerous tissues，glioma cell lines U87 and U251.ResultsNanog gene promoter was hypermethylated in gliomas，and the presence was significantly higher in gliomas than that in the paracancerous tissues（58.82%vs13.63%）（χ2＝14.852，P＜0.01）.Nanog gene promoter unmethylation state was higher in gradeⅢand gradeⅣglioma compared with grade Iand gradeⅡtumors.Nanog gene promoterwas hypermethylated in U87 and U251 cell lines.Nanog mRNA expression levels in high-grade（Ⅲ＋Ⅳ）gliomas were higher than the lowgrade（I＋Ⅱ）group，NanogmRNA expression was significantly increased in U87 and U251 cell lines.ConclusionUnmethylation state of Nanog gene promoter regions is one of themost importantmechanisms thatup-regulate its protein expression and influence the occurrence and development of gliomas.

glioma；Nanog；DNA methylation

R 739.41

A

1000－1492（2015）08－1068－04

2015－04－22接收

国家自然科学基金（编号：81172407）；安徽省重点实验室绩效考核项目（编号：1306c083028）

安徽医科大学附属省立医院1神经外科、2脑功能与脑疾病安徽省重点实验室、3安徽省脑立体定向神经外科研究所，合肥 230001

汪 炎，男，硕士研究生；

牛朝诗，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：niuchaoshi＠163.com