Apobec-1重组腺病毒治疗肾性高脂血症的实验研究

孔海波，胡 波，胡鹏

Apobec-1重组腺病毒治疗肾性高脂血症的实验研究

孔海波，胡 波，胡鹏

目的探讨肝脏获得性表达载脂蛋白B编辑催化多肽-1（Apobec-1）对肾性血脂代谢紊乱的调控效应。方法30只健康普通级雄性新西兰兔随机分为假手术组、肾病组、Apobec-1治疗组，每组10只。肾病组、Apobec-1治疗组适应性喂养1周后行左肾切除术，术后1周耳缘静脉注射阿霉素（4 mg／kg）构建肾病模型。术后11周Apobec-1治疗组耳缘静脉注射Apobec-1重组腺病毒（1×1013病毒颗粒／kg）。术后12周处死所有兔，并摘除右侧肾脏和肝脏，分别留取血液及24 h尿液，检测24 h尿蛋白（24UPr）、白蛋白（Alb）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血脂等指标，HE染色观察肾脏病理，Western blot检测肝脏Apobec-1、载脂蛋白B48（ApoB48）蛋白表达水平。结果①与假手术组比较，肾病组24UPr、BUN、Cr、总胆固醇（TC）、总三酰甘油（TG）、极低密度脂蛋白（VLDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、载脂蛋白B100（ApoB100）明显升高（P＜0.05），而Alb水平明显下降（P＜0.05）；②与肾病组比较，Apobec-1治疗组TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48水平明显下降（P＜0.05）；③与假手术组比较，Apobec-1治疗组24UPr、BUN、Cr明显升高（P＜0.05），而Alb、ApoB48明显下降（P＜0.05）；④Western blot结果显示，与假手术组、肾病组比较，Apobec-1治疗组肝脏Apobec-1、ApoB48表达明显上调（P＜0.01）。结论肾性高脂血症中，肝脏获得性表达Apobec-1，重建ApoB mRNA编辑，增加ApoB48-脂蛋白的合成，进而起到一定的降脂效应。

高脂血症；载脂蛋白B编辑催化多肽-1；载脂蛋白B100；载脂蛋白B48

肾性高脂血症不仅是心血管疾病发生的主要高危因素，且参与肾病进展［1］。目前，传统降脂药物在30%的患者中会出现各种不同程度药物不良反应［2］。所以对于这部分患者，治疗则需另辟蹊径。载脂蛋白B编辑催化多肽-1（apolipoprotein B editing catalytic polypeptide-1，Apobec-1）是调控载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）mRNA编辑的特异性酶复合物中的催化亚基［3］。大量动物实验研究［4-7］证实：通过构建Apobec-1重组腺病毒转染鼠或兔，使肝脏获得性表达Apobec-1，重建ApoB mRNA，具有一定的降脂效应。然而，肾性高脂血症发病机制复杂，上述方法是否有一定降脂效应，仍需进一步探究。该研究采用单侧肾切除单次注射阿霉素制作肾病模型，转染Apobec-1重组腺病毒，观察其对肾病兔血脂代谢及肝脏Apobec-1、载脂蛋白B 48（ApoB48）表达的影响，明确其对肾性血脂代谢紊乱的调控效应。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立及标本制备6月龄健康雄性普通级新西兰兔30只，体重1 000～2 000 g，购自安徽医科大学实验动物中心，动物来源于南京安立默科技有限公司。适应性喂养1周后，将新西兰兔随机分为假手术组、肾病组、Apobec-1治疗组，每组10只。置于代谢笼中饲养。肾病组和Apobec-1治疗组以3%的戊巴比妥30 mg／kg行腹腔注射麻醉，无菌条件下行左肾切除，假手术组只探及肾包膜，并不切除左肾。1周后，肾病组和Apobec-1治疗组耳缘静脉注射阿霉素4 mg／kg，假手术组静脉注射等量生理盐水。术后11周，Apobec-1治疗组耳缘静脉注射Apobec-1重组腺病毒。术后12周，禁食12 h后第2天抽取血标本及留取24 h尿液，随后全部处死，血液、尿液及时送检；摘除肾脏，滤纸吸干后于10%中性福尔马林溶液固定，待做肾脏病理检查；摘除肝脏，滤纸吸干后称重，剪取部分组织置EP管中，于－80℃低温冰箱保存，待做Western blot检测。

1.2 主要仪器及试剂UV-1200分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；TS-A型脱色摇床（上海沪粤明科学仪器有限公司）；DYY-TC型电泳仪（北京市六一仪器厂）；SZ-1型快速混匀器（江苏省金坛市友联仪器研究所）；Tanon-5500发光成像系统（上海天能科技有限公司）；D-78532 Tuttlingen离心机（广东省医疗器械厂）；Apobec-1重组腺病毒（上海吉玛制药技术有限公司）；阿霉素（北京雅安达生物公司）；兔源抗Apobec-1多克隆抗体（北京奥维亚生物技术有限公司）；山羊抗ApoB48多克隆抗体（美国Abcam公司）；ECL-发光液（美国Thermo scientific公司）；常规试剂均为国产。

1.3 构建Apobec-1重组腺病毒①TRIzol法提取SD大鼠肠道总RNA；②RT-PCR扩增Apobec-1全长cDNA；③将rApobec-1基因装载至pUC57-Simple载体上；④pYr-ads-4-rApobec-1构建；⑤通过LR体外同源重组将rApobec-1表达框构建至pAd／PL-DEST腺病毒表达载体上；⑥包装重组腺病毒。

1.4 血尿指标及肾脏病理检测方法双缩脲比色法检测24 h尿蛋白浓度（24 hour urinary protein，24UPr）；酶法测定白蛋白（albumin，Alb）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、总三酰甘油（total triglyceride，TG）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）浓度；Friedewald公式估算血浆极低密度载脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL-C）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）浓度；放射免疫法测定血浆载脂蛋白B100（ApoB100）和ApoB48浓度；HE染色观察肾脏病理改变。

1.5 Westernblot检测肝脏Apobec-1和ApoB48表达水平常规方法提取肝脏总蛋白，测定其蛋白浓度，将蛋白浓度稀释至同一浓度；制备SDS-PAGE凝胶；电泳；转膜；5%脱脂牛奶封闭过夜；加入一抗（兔源抗Apobec-1多克隆抗体1∶500；羊源抗ApoB48多克隆抗体1∶1 000；鼠源抗β-actin单克隆抗体1∶2 000），室温孵育2 h，0.05%PBST洗3次，每次10 min，PBS洗1次，每次10 min；加入二抗（HRP标记的羊抗兔二抗1∶50 000；HRP标记的兔抗羊二抗1∶50 000；HRP标记的羊抗鼠二抗1∶ 100 000），室温孵育3 h，0.05%PBST洗3次，每次10 min，PBS洗1次，每次10 min；在发光成像系统中进行ECL显色、曝光、拍摄；对条带进行相对光密度分析，通过与内参β-actin的条带光度值的比值间接反映Apobec-1及ApoB48的表达水平。

1.6 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，数据以±s表示，两两比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 血尿生化指标比较3组之间血尿指标比较显示24UPr、Alb、BUN、Cr、TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。与假手术组相比，肾病组24UPr、BUN、Cr、TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100明显升高（P＜0.05），Alb明显下降（P＜0.05），而HDL-C、ApoB48未见明显变化；与肾病组相比，Apobec-1治疗组TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48明显下降（P＜0.05），而24UPr、Alb、BUN、Cr、HDL-C未见明显变化；与假手术组比较，Apobec-1治疗组24UPr、BUN、Cr增高（P＜0.05），Alb、ApoB48下降（P＜0.05），而TC、TG、VLDL-C、LDL-C、HDL-C、ApoB100未见明显变化，见表1。

2.2 肾脏病理学改变假手术组肾脏病理显示肾组织结构无明显异常；肾病组和Apobec-1治疗组肾脏病理显示肾脏组织细胞增生肥大、排列紊乱，肾小球囊壁增厚，局部可见粘连，肾间质增宽，充满基质，可见大量炎性细胞浸润，部分可见肾小球局灶性坏死，见图1。

2.3 肝脏Apobec-1、ApoB48蛋白表达变化

Westernblot结果显示，与假手术组比较，肾病组Apobec-1、ApoB48蛋白表达未见明显变化；与肾病组、假手术组比较，Apobec-1治疗组Apobec-1、ApoB48蛋白表达明显上调（P＜0.01），见图2。

表1 各组血尿生化指标比较（n＝10，±s）

表1 各组血尿生化指标比较（n＝10，±s）

与假手术组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与肾病组比较：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

指标假手术组肾病组Apobec-1治疗组F值P值24UPr（g／L）0.28±0.13 1.40±0.35**1.38±0.38**42.778 0.000 Alb（g／L）54.43±6.00 48.52±5.78*47.59±6.15*3.819 0.034 BUN（mmol／L）7.91±1.35 9.64±1.21**10.27±1.94**6.562 0.005 Cr（μmol／L）82.70±10.44 127.00±22.07**123.25±24.14**16.076 0.000 TC（mmol／L）0.88±0.10 1.28±0.25**0.93±0.09＃＃17.531 0.000 TG（mmol／L）0.66±0.14 1.03±0.38**0.72±0.14＃6.192 0.006 VLDL-C（mmol／L）0.30±0.07 0.47±0.17**0.33±0.06＃6.192 0.006 LDL-C（mmol／L）0.10±0.03 0.31±0.10**0.09±0.02＃＃34.924 0.000 HDL-C（mmol／L）0.48±0.11 0.50±0.06 0.51±0.04 0.511 0.605 ApoB48（mg／L）23.14±0.63 23.35±1.29 21.75±1.04*＃＃6.161 0.006 ApoB100（mg／L）25.46±1.11 27.36±2.03*25.15±1.90＃＃5.180 0.012

3 讨论

高脂血症是肾病综合征的典型表现，包括高TC血症，高TG血症，常伴有LDL-C、VLDL-C、中间密度脂蛋白及脂蛋白a的升高，以及HDL-C降低或不变［8］。其中，高TC血症是肾病最常见的高血脂类型［9］。高TC血症主要以LDL-C升高为主，其机制［9］主要表现为：①HMG-CoA还原酶升高；②胆固醇7α羟化酶下降；③低密度脂蛋白受体缺陷；④酯酰辅酶A胆固醇脂酰转移酶2代偿升高。可见，肾性高脂血症发生机制极其复杂。目前肾病综合征模型的建立，主要采用单侧肾切除后单次注射阿霉素构建，一般3个月左右可出现肾病综合征典型表现［10］。且该方法具有死亡率低、成模率高、重复性好及方法简短等优点。本研究通过上述方法建立肾病模型，结果显示肾病组血尿生化指标和肾脏病理与临床人类肾病综合征临床和病理特征相类似［11］，且血脂类型符合高TG血症，为进一步实验提供一定的模型基础。

ApoBmRNA编辑是调控血浆脂蛋白代谢的重要遗传机制［12］。其编辑过程主要受特异性酶复合物调控。维持特异性酶复合物活性至少需要两种亚单位同时存在，即催化亚基（ApoB编辑催化多肽-1）和结合亚基（Apobec-1辅助因子）。在人类和兔中，ApoBmRNA虽可在肠道发生广泛编辑而合成ApoB48，但在肝脏却不被编辑而仅分泌全基因转录产物ApoB100［13］。人类和兔Apobec-1基因缺少肝脏特异性启动子序列是导致上述器官差异性表达Apobec-1的主要原因［13］。然而，在其它一些哺乳动物（如：狗、马和鼠类），ApoBmRNA在肝脏和肠道均可被编辑而合成分泌ApoB48-脂蛋白，同时伴随低血浆ApoB100-脂蛋白［14］。现有的研究显示，通过转染Apobec-1重组腺病毒，可在肝脏短期表达Apobec-1，这种方式的降脂作用已在多种动物模型中得到体现［4-7］。本研究选用肾病兔为动物模型，转染Apobec-1重组腺病毒1周后发现，Apobec-1治疗组的血脂水平明显低于肾病组，且与假手术组血脂水平基本持平。可见，肾性高脂血症中，通过转染Apobec-1重组腺病毒可起到一定降脂效应。本研究通过Westernblot法检测肝脏Apobec-1、ApoB48的表达，结果显示Apobec-1治疗组肝脏Apobec-1、ApoB48表达明显高于肾病组及假手术组。可见，通过转染Apobec-1重组腺病毒，可使肾病兔肝脏获得性表达Apobec-1，促进肝脏ApoBmRNA重建，增加ApoB48-脂蛋白的合成。然而，本研究观察各组血清ApoB100、ApoB48变化显示，与肾病组比较，Apobec-1治疗组血清ApoB100、ApoB48均有所下降。既往有研究［15］显示ApoB20、ApoB40可以形成pre-VLDL，但是形成的pre-VLDL在囊泡运输过程中受到阻碍，以至于VLDL组装的效率极低，但当截断物达到ApoB48，VLDL组装的效率大大提高。故此，本研究提出Apobec-1治疗组血清ApoB48下降可能为其代谢速率迅速所致，但其代谢机制尚需进一步探究。

综上所述，肾性高脂血症中，通过转染重组腺病毒，可使肝脏获得性表达Apobec-1，促进肝脏ApoB mRNA编辑，增加ApoB48-脂蛋白的合成，具有一定降脂效应。

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Experimental study of Apobec-1 recombinant adenovirus in treatment of renal hyperlipem ia

Kong Haibo，Hu Bo，Hu Peng
（Dept of Pediatric，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To explore the effect of the liver acquired expression of apolipoprotein B editing catalytic polypeptide-1（Apobec-1）on hyperlipidemia of renal disease.MethodsThirty healthy ordinary levelmale New Zealand rabbits were randomly divided into three groups：sham operation group，nephropathy group，and Apobec-1 treatment group（Each group has10 rabbits）.Adapt feeding for one week，nephropathy group and Apobec-1 treatment group underwent left nephrectomy，and one week later，adriamycin（4mg／kg）was used to construct the nephropathymodel by ear vein injection.The eleventh week after operation，apobec-1 recombinant adenovirus（1× 1013Virus／kg）was injected by ear vein in apobec-1 treatment group.The twelfth week after operation，all rabbits were sacrificed.Right kidney，liver，blood and 24h urine were left.In three groups，24 hour urinary protein（24UPr），albumin（Alb），blood urea nitrogen（BUN），creatinine（Cr），blood lipid were detected.Renal pathology was observed by HE staining.Expressions of liver apobec-1，apolipoprotein B48（ApoB48）were observedby Western blot.Results①Compared with the sham operation group，nephropathy group showed that 24UPr，BUN，Cr，total cholesterol（TC），total triglyceride（TG），very low density lipoprotein（VLDL-C），low density lipoprotein（LDL-C），apolipoprotein B100（ApoB100）were increased（P＜0.05），but Alb was decreased（P＜0.05）.②Compared with the nephropathy group，Apobec-1 treatmentgroup showed that TC，TG，VLDL-C，LDLC，ApoB100，ApoB48 were decreased（P＜0.05）.③Compared with the sham operation group，Apobec-1 treatment group showed that 24UPr，BUN，Cr were increased（P＜0.05），but Alb，ApoB48 were decreased（P＜0.05）.④Compared with the sham operation group and nephropathy group，Apobec-1 treatmentgroup showed that the expression of Apobec-1 and ApoB48 were up-regulated（P＜0.01）.ConclusionWhen liver aquires expression of Apobec-1 in hyperlipidemia of renal disease，it can reconstruct ApoB mRNA，increase the synthesis of ApoB48-lipoprotein，and play a certain lipid-lowering effect.

hyperlipidemia；apolipoprotein B editing catalytic polypeptide-1；apolipoprotein B100；apolipoprotein B48

R 726.92

A

1000－1492（2015）08－1049－05

2015－04－29接收

安徽省自然科学基金（编号：1208085MH153）

安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥 230022

孔海波，男，硕士研究生；

胡 波，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：hubo3218＠sohu.com