高效液相色谱法测定益精散中2，3，5，4`—四羟基二苯乙烯—2—O—β—D—葡萄糖苷含量

令狐昌敏 程玲玲 谭翔匀

【摘   要】 目的  建立HPLC法测定益精散中2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。方法  色谱柱为Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5ul），以乙腈-水（20：80）为流动相;流速为：1.0ml？min-1;检测波长为320nm。结果  2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷线性范围为0.20μg-0.46μg（r=0.9999）;平均回收率为98.7%，RSD为0.89%。结论  本法简便、灵敏、准确。

【关键词】 HPLC;益精散;2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷;含量测定

【中图分类号】 R284    【文献标识码】 A

益精散由何首乌、南五味子、枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子、熟地黄、淫羊藿、锁阳、巴戟天、山茱萸、肉苁蓉等十二味中药组成，具有温肾壮阳、滋阴补肾、疏肝通气、活血通精的功效。用于无精子症、少精子症、死精子症、畸形精子症等。原标准中无主要药材的含量测定方法，本试验参照《中国药典》2010版一部何首乌含量测定项[1]，用高效液相法测定2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，作为控制本品的质量依据，结果该方法簡便易行，结果可靠。

1  仪器与试药

1.1  仪器  岛津LC-20AD型高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，KQ-300DE超声仪，AB204-S型万分之一和AB265-S型十万分之一梅特勒-托利多电子天平。

1.2  试药  2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品（中国食品药品检定研究院 批号：110844-201310，纯度91.0%）;益精散（5g/袋，贵州百花医药股份有限公司受托配制）乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他均为分析纯。

2  实验方法和结果

2.1  色谱条件  色谱柱：Diamonsil C18（250mm×4.6mm ，5μm）;流动相：乙腈-水（20：80）;流速为：1.0ml？min-1;柱温30℃;检测波长为320nm。进样量20μl，理论塔板数按2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计不低于3000。

2.2  系统适应性考察

2.2.1  对照品溶液制备  十万分之一电子天平精密称取2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品（批号：110844-201310，纯度91.0%）9.75mg，置50ml棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备溶液。再精密量取对照品贮备溶液3ml置25ml容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得0.0213mg/ml的对照品溶液。

2.2.2  供试品溶液制备  取供试品内容物，混匀，精密称取0.2g，置25ml棕色容量瓶中，加稀乙醇20ml，超声30min，取出，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，过虑制得供试品溶液。

2.2.3  阴性对照溶液的制备  参照贵州省食品药品监督管理局黔制剂字Z20030354益精散制备工艺制备缺制何首乌益精散，照“2.2.2”法制备缺制何首乌阴性对照溶液。照“2.1”项的色谱条件，分别精密吸取上述溶液各20ul进样，结果在2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品主峰相同的位置上，供试品溶液在主峰位置上出峰，阴性对照溶液无色谱峰出现，，阴性对照品色谱峰与阳性对照品色谱峰叠加，与供试品色谱图相似性良好。表明本法的专属性良好，阴性不干扰本法的测定。见图1-图3。

图1  2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷

HPLC对照图谱

图2  益精散样品HPLC图谱

图3  缸制何首乌的益精散样品HPLC图谱

2.3  线性关系的考察  精密吸取浓度（0.0213mg/ml）对照品溶液，分别进样5、10、15、20、25、30、35ul，测定峰面积，以2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标，计算2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷回归方程为：Y= 3590243 x-25603  r=0.9997。结果表明2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.11μg-0.76μg范围内线性关系良好。

2.4  精密度试验  精密吸取供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪中，连续测定5次，其峰面积的RSD=0.41%，结果表明精密度良好。

2.5  稳定性试验  精密吸取供试品溶液20μl，分别在0、2、4、8、12小时测定一次，其峰面的RSD为1.36%，表明供试品溶液在12小时内基本稳定。

2.6  重复性试验  精密称取本品粉末约0.2g，共5份，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。精密吸取溶液各20μl，测定2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积积分值，平均含量为0.27%，RSD=1.11%，结果表明，重复性良好。

2.7  加样回收试验  取已知含量（2.72mg/g）的样品6份，每份约为0.1g，精密称定，分别精密加入已知浓度的2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷溶液（0.177 mg/ml，稀乙醇制）1、1.5、2 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.8”项下的方法操作，计算回收率，结果见表1。

2.8  含量测定  分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，按外标法以峰面积计算含量，结果见表2。

4  讨论

4.1  2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在强光、碱性条件下极不稳定，故试验时要避光操作。

4.2  益精散原标准中，无主要药材的含量测定方法，鉴于制何首乌在本方中所起的补肝肾，益精血，安神作用，本研究以2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量为指标，结果在实验测定条件下其HPLC峰不受杂质峰的干扰，测试结果比较准确，可为益精散质量标准的完善提供参考。

4.3  参照何首乌药材的含量测定条件，试验了流动相乙腈-水不同的比例（25：75）和（20：80），结果发现采用乙腈-水（25：75）样品不能达到基线分离，故确定流动相乙腈-水为（20：80）。

4.4  样品提取方法，试验了加热回流1h与超声处理30min[2]，结果含量无显著差异，故确定超声提取时间为30min。

参考文献

[1] 国家药典委员会主编.中华人民共和国药典[M].第1部.北京：化学工业出版社，2010：717.

[2] 陆蕴如，邓巧虹，等.何首乌及其制剂中2，3，5，4`-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量测定研究[J].北京中医药大学学报， 1998，21（6）：31-33.