手足口病不同核酸检测方法敏感性比较

吕厚明 房本兰 姜亚楠

【摘 要】 手足口病（HFMD）是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。以发热和手、足、口腔等部位的皮疹和疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。引起手足口病的肠道病毒有二十几种，其中能够引起比较严重后果的主要有两种，分别是EV71型和CA16型。2008年手足口病在全国爆发性流行，导致众多的重症患儿病情严重，甚至发生了死亡病例，经过实验室检测发现，2008年的主要流行型别就是EV71型，该型别也是肠道病毒中能够导致重症患儿的头号病毒。从2008年以来，国家对手足口病越加重视，坚持不懈开展监测工作。经过这几年的连续监测，我中心对本溪市手足口病的流行情况有了大概的了解，为医院的治疗工作提供了可靠的理论依据。

【关键词】 手足口病；肠道病毒；重症患儿；EV71；CA16

【中图分类号】 R446 【文献标识码】 B

手足口病的核酸检测目前常有的方法有两种：一是普通RT-PCR法，二是荧光定量PCR法，这两种方法均各有利弊，现将这两种检测方法的不同特点进行对比。

1 仪器设备和试剂耗材

1.1 仪器设备 荧光定量PCR仪：IQ5型，普通PCR仪基因扩增仪：东胜创新EDC-810，电泳仪：瑞典EPS-601，电泳槽：上海Tanon天能HE120，紫外凝胶成像仪：日本KODAK柯达GEL LOGIC 200。

1.2 主要试剂耗材 核酸提取—QIAGEN RNA核酸提取试剂盒（No.74104），对比试剂—QIAGEN荧光定量核酸检测试剂盒，QIAGEN一步法RT-PCR核酸检测试剂盒，凝胶电泳—GENE TECH琼脂糖（REGULAR），上海生工生物—5xTBE缓冲液。

1.3 检测方法 《手足口病预防控制指南》（2009年版）。

2 检测程序

2.1 核酸检测

2.1.1 核酸提取 用QIAGEN RNA核酸提取试剂盒（No.74104）对样品进行核酸提取，样品为患儿粪便样品，提取方式为滤柱式，将提取到的RNA核酸放置于4℃以下待用。

2.1.2 核酸扩增

A RT-PCR一步法

①核酸扩增 反应体系、反应条件和时间（EV71型）详见表1。

②琼脂糖凝胶电泳 配置1.5%琼脂糖凝胶：将5x TBE缓冲液稀释为1x——100ml缓冲液加入1.5g琼脂糖粉充分混匀——放入微波炉内中火加热至沸腾，拿出摇匀，再加热沸腾直到琼脂糖完全溶解均匀——冷却至45℃-50℃加入荧光染料EB替代物，100ml加1μl充分混匀——倒入摆放好的模具中至完全冷却凝固——将凝胶放入装满1x TBE缓冲液的电泳槽中，淹没胶面——将核酸产物混合Loading Buffer加入凝胶孔中——打开电泳仪电源，设置电压80V-100V，至样品跑至胶面2/3处为止——放入紫外凝胶电泳仪查看结果。详见图1。

共计样品16份，加上阴阳性对照和2孔Mark DL2000，共计20孔，EV71亚型目标条带为226bp，共得出强阳性结果8份、弱阳性结果5份、阴性3份。

B 荧光定量PCR法反应体系、反应条件和时间（EV71型）详见表2。

结果详见图2、表3。

共计样品16份，共得出强阳性结果13份、弱阳性结果1份、阴性2份。

3 结果分析

可以看出荧光定量PCR法在敏感性和检出率方面要好于普通PCR法，而且操作步骤简单，重复性和直观性好，建议在检测手足口病方面使用改方法。

4 总结

我国手足口病疫情一直比较严重，选择简单、敏感、时间短的检测方法对疫情的防控患儿的救治有很大的帮助作用。RNA细菌是导致幼儿或其他年龄段病人感染手足口病的根本原因。在临床诊断中，医生通常需要运用核酸检验方式为病人诊断病情。核酸检验首先要对标本采取逆转录处理，使RNA以DNA的形式显现，接着再分析特殊DNA的排列方式，并对DNA进行检验。当前基层医院主要运用常规RT-PCR技术为病人进行检验，从实际检测情况来看，受到条件局限RT-PCR技术的检验准确率无法达到理想效果，因此笔者在上文中，通过对比实验分析了荧光定量PCR法和常规RT-PCR法两种方式在临床中检验小儿手足口病的效果。在常规RT-PCR检测下，有13份标本呈现阳性，3份量标本呈现阴性。在13份呈现阳性的标本中，有5份显现弱阳性，8份显现为强阳性，检验准确率为50%。在荧光定量PCR检测下，有14份标本呈现阳性，2份量标本呈现阴性。在14份呈现阳性的标本中，有1份份量标本呈现弱阳性，13份呈现强阳性，阳性检验准确率为81.25%。根据数据统计结果可知，相比常规RT-PCR检测模式而言，运用荧光定量法对手足口疾病标本进行检测的阳性准确率更高。同时，荧光检验法使用仪器较少，并且檢验操作简易，即使是基层的中小型医院也可以运用这种方式为幼儿进行手足口疾病检验，提高临床诊断的准确率，使幼儿能够及时获得治疗。因此，基层医疗单位应普及荧光定量PCR检测法。

参考文献

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