仙附温阳通络饮对血栓闭塞性脉管炎模型大鼠抗中性粒细胞抗体相关抗原的影响

赵晶等

摘要：目的 观察仙附温阳通络饮对血栓闭塞性脉管炎（TAO）模型大鼠抗中性粒细胞抗体（ANCA）相关抗原的影响，探讨其作用机制。方法 SPF级Wistar雄性成年大鼠72只，随机分为假手术组、模型组、脉络宁颗粒组及仙附温阳通络饮低、中、高剂量组。以股动脉注射月桂酸钠溶液方法造模。造模后次日开始给药，假手术组、模型组给予蒸馏水灌胃，其他各组给予相应药物灌胃。给药15 d后取材，采用紫外分光光度法检测血清中髓过氧化物酶（MPO）活性，免疫组化法检测股动脉及周围组织中蛋白酶3（PR3）和溶酶体相关膜蛋白-2（LAMP-2）蛋白表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠血清中MPO活性及PR3、LAMP-2蛋白表达均升高；与模型组比较，各给药组MPO活性及PR3、LAMP-2蛋白表达降低，其中仙附温阳通络饮中剂量组下降最明显。结论 仙附温阳通络饮可能通过降低ANCA相关抗原水平，进一步抑制体液免疫功能亢进。

关键词：仙附温阳通络饮；血栓闭塞性脉管炎；抗中性粒细胞抗体；髓过氧化物酶；蛋白酶3；溶酶体相关膜蛋白-2；体液免疫；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0080-04

血栓闭塞性脉管炎（thromboangiitis obliterans， TAO）是一种节段性、非粥样硬化性、阻塞性血管疾病，病变主要累及肢体远端的中小动脉和静脉，属中医“脱疽”范畴。由于该病具有高致残率及易复发特性，且流行病学调查显示，其发病年龄有提前趋势，非吸烟人群及女性也有发生[1]，因而引起学者的广泛关注和深入研究。前期临床研究表明，仙附温阳通络饮对TAO具有独特的疗效[2]。本研究通过观察仙附温阳通络饮对TAO模型大鼠血清及组织中抗中性粒细胞抗体（ANCA）特异性抗原髓过氧化物酶（MPO）活性及蛋白酶3（PR3）、溶酶体相关膜蛋白-2（LAMP-2）蛋白表达的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

Wistar雄性成年大鼠72只，体质量（300±50）g， SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。动物饲养于黑龙江省中医药科学院动物实验中心屏障系统，水和饲料（北京科奥协力饲料有限公司）自由饮食，水为pH 3.0酸化纯净水。

1.2 药物

仙附温阳通络饮方（附子、淫羊藿、黄芪、党参、肉桂、赤芍等），江阴天江药业有限公司，批号1405057；脉络宁颗粒，江西银涛药业有限公司，批号1304015；月桂酸钠，天津市博迪化工有限公司，批号20120529。

1.3 主要试剂与仪器

PR3（D-1）Antibody，美国Santacruz公司，货号sc-74534；MPO测试盒，南京建成生物有限公司，货号A044；LAMP-2（H-207）Antibody，美国Santacruz公司，货号sc-5571；山羊抗兔IgG抗体，北京中杉金桥生物技术公司，货号PV-6001。紫外可见分光光度计，澳大利亚GBC公司；冰冻切片机，德国Leica公司；CX40光学显微镜，日本Olympus公司。

2 实验方法

2.1 分组

实验鼠基础饲料适应性喂养1周后，随机分成假手术组、模型组、脉络宁组和仙附温阳通络饮低、中、高剂量组（低、中、高剂量组），每组12只。

2.2 造模

参考文献[3]方法，采用股动脉注射月桂酸钠溶液方法造模：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，向右后肢股动脉远心端注入0.1 mL浓度为10 g/mL月桂酸钠溶液，假手术组注射生理盐水。手术完毕后给予腹腔注射青霉素，以防感染。

2.3 给药

假手术组、模型组给予蒸馏水灌胃，脉络宁组和低、中、高剂量组给予脉络宁溶液和不同剂量仙附温阳通络饮溶液灌胃。根据人与大鼠单位体质量折算系数计算原药材含量，其中脉络宁溶液含原药材0.27 g/mL，低、中、高剂量组给予仙附温阳通络饮溶液0.734、1.467、2.934 g/mL，中剂量组原药材含量相当于临床成人用药量。给药体积10 mL/（kg·d），连续15 d。

2.4 指标检测

10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，经腹主动脉采集血液标本，EDTA抗凝，4 ℃、3000 r/min离心6 min，取上清液分装，按MPO测试盒于说明进行样本前处理，应用紫外分光光度计检测各组实验大鼠血清对照管及测定管的光密度（OD值），并计算MPO活性[（测定OD值-对照OD值）÷11.3×取样中所含血清量]。

患肢分离后取月桂酸注射处以下部位的股动脉及周围肌肉组织，置于4%多聚甲醛固定，待组织被完全浸透后取出室温晾干，经二甲苯透明、梯度乙醇组织复水、抗原修复、石蜡包埋切片，行组织化学染色、脱水封片等常规免疫组化方法处理后，于镜下观察大鼠股动脉及周围组织PR3、LAMP-2蛋白表达变化，并拍照留存，应用ImagePro Plus6.0软件进行蛋白表达半定量分析。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 仙附温阳通络饮对模型大鼠血清中髓过氧化物酶活性的影响

与假手术组比较，大鼠造模后血清中MPO活性升高（P<0.01），说明TAO造模成功。与模型组比较，各给药组MPO活性降低（P<0.05，P<0.01），其中，中剂量组下降最明显。结果见表1。

4.2 仙附温阳通络饮对模型大鼠股动脉及周围组织中蛋白酶3、溶酶体相关膜蛋白-2蛋白表达的影响

高倍镜下观察，模型组大鼠股动脉及周围组织中PR3、LAMP-2蛋白表达增加，主要集中于中性粒细胞的胞浆内，围绕在细胞核周围，见图1、图2。结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠PR3、LAMP-2蛋白表达量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，中、高剂量组PR3、LAMP-2蛋白表达量降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

5 讨论

TAO的发病机制至今尚未明确，但免疫学方面的研究进展提示该病的发生存在体液免疫功能的异常[4]。其中ANCA被广泛认为在TAO发病机制中起重要作用，是临床检验常用的重要指标之一[5]。迄今为止，已有10余种中性粒细胞胞浆成分被证实为ANCA的靶抗原，其中较为经典的是MPO和PR3[6]。研究表明，LAMP-2在细胞黏附、抗原递呈和维持细胞稳态中起重要作用[7]。尽管ANCA的抗原种类繁多，但不同的抗原系统与不同的疾病发生相关，迄今为止，大多数学者研究认为，TAO的发生与MPO、PR3和LAMP-2密切相关。

中医认为，肝肾亏虚、精血不足是脱疽发生的重要因素，临床以温阳通络为基本治疗法则。仙附温阳通络饮以附子、淫羊藿为君药，以黄芪、肉桂、党参、赤芍等为臣药，立旨于温肾散寒、活血行气、通络止痛。现代药理研究表明，方中君药附子能显著增强肾上腺皮质激素的分泌，调节体液免疫中各种免疫球蛋白代谢，从而增强机体的免疫功能[8]；淫羊藿中的主要化学成分淫羊藿总黄酮亦可通过直接增加免疫细胞数量，促进免疫细胞分泌淋巴因子，提高体液免疫和细胞免疫能力，进而增强机体免疫力[9]；臣药黄芪能提高免疫球蛋白的分泌和排泄、促进抗体产生、对B淋巴细胞免疫功能具有明显的增强作用[10]。纵观全方，仙附温阳通络饮可以通过直接影响细胞内物质代谢或诱导机体细胞产生相关体液因子等途径调节机体的免疫功能。本实验研究发现，与假手术组比较，TAO模型大鼠血清中MPO活力、股动脉血管及周围肌肉组织中PR3和LAMP-2蛋白表达显著升高（P<0.01），与文献报道的MPO、PR3和LAMP-2抗原与TAO发生有关相符。与模型组比较，各给药组上述指标均不同程度降低（P<0.05），中剂量组治疗后效果最为显著（P<0.01）。表明临床剂量仙附温阳通络饮对月桂酸所致的TAO模型大鼠具有较好的治疗作用，其作用机制可能与降低ANCA相关抗原水平、进一步抑制体液免疫功能亢进相关。

参考文献：

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[10] 索贞，任敏，周好田.黄芪的化学成分及现代药理[J].现代医院，2005， 5（9）：85.

（收稿日期：2014-12-11；编辑：华强）