子午流注纳甲法对急性缺血性脑卒中大鼠神经元特异性烯醇化酶、S100B蛋白的影响

商俊芳等

摘要：目的 观察子午流注纳甲法对急性缺血性脑卒中（AIS）模型大鼠血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）、S100B蛋白含量的影响。方法 选用SPF级SD雄性大鼠，采用大脑中动脉线栓法建立模型，按随机数字表法分为空白组、假手术组、模型组、循经组和纳甲组，空白组、假手术组和模型组不作治疗，循经组予循经辨证取穴针刺治疗，纳甲组予子午流注纳甲法针刺治疗，每日定时治疗1次，观察神经功能及脑梗死体积情况，检测血清NSE、S100B蛋白的含量。结果 与模型组比较，循经组、纳甲组神经功能评分下降、梗死灶体积减小、梗死灶体积百分比降低（P<0.05，P<0.01），血清NSE、S100B蛋白含量降低（P<0.05，P<0.01），纳甲组效果总体优于循经组。结论 子午流注纳甲法通过降低AIS模型大鼠血清NSE、S100B蛋白含量达到神经保护和治疗作用。

关键词：子午流注纳甲法；急性缺血性脑卒中；S100B蛋白；神经元特异性烯醇化酶；大鼠

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0054-04

急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke， AIS）发病率、病死率、致残率较高。近年来，随着饮食结构及行为方式的变化，加之社会人口老龄化进程加剧，AIS发病率逐年升高，选择一种有效治疗方案及时救治，是改善预后、提高患者生活质量的关键。笔者应用子午流注纳甲法针刺治疗AIS患者，疗效较好[1]。脑缺血后神经胶质细胞的坏死和血脑屏障的破坏使神经元特异性烯醇化酶（NSE）和S100B蛋白从脑组织溢出到血管腔隙[2]，其血清中水平变化能够反映脑损伤程度及疾病预后。因此，本研究观察子午流注纳甲法对AIS模型大鼠血清中NSE、S100B蛋白的影响，为临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康成年SD雄性大鼠60只，3月龄，SPF级，体质量（200±20）g，甘肃中医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK（甘）2011-0001。饲养于甘肃中医学院实验中心SPF级实验室，适应性喂养1周，术前8 h禁食。所有动物按体质量编号，按随机数字表法分组，抽取12只为空白组，12只为假手术组，其余进行造模。符合纳入标准的造模成功大鼠再分成模型组、循经组、纳甲组，每组12只。

1.2 针具与仪器

华佗牌25 mm×0.32 mm美容针灸针，苏州针灸器械厂。BP-1215型Sartorius分析天平，北京多利斯天平有限公司；TLS-2000A型电子秤，常熟双杰测试仪器厂；TCG-16B型台式低速离心机，上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂；DW-86L828型超低温冰箱，中国海尔公司；CMIAS-108型多媒体病理图像分析仪，北京航空航天大学研制。氯化2，3，5-三苯基四氮唑（TTC），化学纯，北京福星化工厂；NSE、S100B蛋白试剂盒，上海源叶生物科技有限公司。

1.3 造模

参考文献[3]方法，大脑中动脉线栓法制备大鼠AIS模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于鼠板上，剪除颈部毛发并消毒，在颈部正中纵行切长约2 cm的开口，钝性分离皮下筋膜、肌肉，充分暴露右侧颈总动脉（CCA）及分支颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA），游离右侧CCA，分别在CCA近心端、ECA及CCA远心端挂线备用，用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。在CCA上距分叉部4 mm处剪一小口，将备用栓线插入至ICA，扎紧CCA远心端的线以固定栓线，松开动脉夹，直至遇到少许阻力为止，从CCA分叉部起插入深度约为18～19 mm，术毕检查无活动性出血后，将线头置于体内，缝合皮肤。整个手术过程中环境温度（25.0±1.0）℃，保证大鼠生命体征稳定。术后单笼饲养，自由进食、饮水。假手术组处理方法同上，但不插线栓，仅分离右侧CCA、ICA及ECA。大鼠麻醉清醒后，进行神经系统评分，1～3分为造模成功，用于实验，0分及昏迷不醒者剔除并补充。

1.4 治疗

大鼠清醒后当日开始治疗，每日同一时间治疗1次，直至处死动物为止。空白组、假手术组和模型组每日只进行相同抓取，同期同步饲养，不作任何治疗。参照文献[4-5]穴位定位或类比取穴。循经组循经辨证选取“百会”向后斜刺、“合谷”直刺、“三阴交”直刺。纳甲组在循经辨证取穴基础上根据文献记载徐氏子午流注纳甲法[6]，依日按时开穴针刺治疗，所开穴位为主穴先刺，循经辨证取穴为配穴后刺。每次留针20 min，针刺深度依穴位而定，均采用平补平泻法。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 一般情况及神经功能 每日观察所有大鼠的精神状态、皮毛光泽及亮度、自主活动、肢体运动、摄食情况、体质量变化。采用改良Bederson[7]及Longa[3]的方法进行4分制行为功能评分。0分：无明显神经功能缺损症状；1分：不能完全伸展左侧（瘫痪侧）前肢，提鼠尾离开地面30 cm，左前肢表现为腕屈曲、肘屈曲、肩内旋或兼而有之；2分：行走时，大鼠向左侧（瘫痪侧）转圈；3分：行走时，大鼠身体向左侧（瘫痪侧）倾倒或轻推肩部时即向左侧倾倒；4分：不能自行行走或意识丧失。

1.5.2 血清中神经元特异性烯醇化酶、S100B蛋白含量测定 治疗7 d后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，股动脉采血5 mL，注入离心管中，待凝固后（30～40 min），3000 r/min离心10 min，分离血清，置于-20 ℃冰箱备测。NSE、S100B蛋白含量采用ELISA测定，按照试剂盒使用说明操作。

1.5.3 脑梗死体积测定 采血后大鼠迅速断头处死，打开颅骨取脑，用生理盐水冲洗后，放入-20 ℃冰箱中冰冻至适当硬度（约15 min）。取速冻大鼠脑组织，在视交叉处从枕极到额极冠状位切脑，其后间隔2 mm连续做6个冠状切片，放入2%TTC液中，37 ℃水浴箱中避光孵育20 min（10 min翻面）染色，正常脑组织染为玫瑰红色，脑梗死区不染色（白色），滤除TTC液，置于新鲜配制的4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，脑片按脑的前后顺序整齐排列保存。数码照相机拍照后输入计算机，采用图像分析软件进行分析，计算每个层面梗死灶面积，将梗死灶面积乘以层厚（2 mm），得出每个层面的梗死灶体积，各层面的梗死灶体积相加即得出整个脑组织的梗死灶体积，同时计算前脑总体积及脑梗死范围占同侧大脑百分比（%）。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。所有数据以—x±s表示，两组间比较采用t检验（方差不齐时用t检验），多组间比较采用方差分析及q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及神经功能评定

手术大鼠均于术后1 h内清醒，假手术组较早出现摄食活动。造模大鼠均于术后2～3 d内出现活动减少，一般情况较差，精神萎靡喜卧，闭目不喜睁眼，反应迟钝，食欲减退，毛发枯燥无光泽，肌肉瘦削，体重减轻，3 d后自主活动增加，皮毛光泽及亮度渐好转，精神状态亦有明显改善，体质量增加，纳甲组整体状况恢复较模型组和循经组快。空白组及假手术组大鼠活动正常，无神经功能缺损症状，神经功能评分为0分。术后3 h，循经组及纳甲组神经功能评分与模型组比较略下降，但差异均无统计学意义（P>0.05）。术后3 d，纳甲组神经功能评分与模型组比较明显下降（P<0.05，P<0.01）。纳甲组与循经组神经功能评分比较各时点差异均无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

2.2 子午流注纳甲法对大鼠梗死灶体积的影响

空白组及假手术组无梗死灶形成。造模大鼠梗死侧大脑半球水肿明显，体积明显大于对侧，经TTC染色后，均在梗死侧大脑皮层出现边界清晰、范围恒定的苍白梗死灶，提示造模理想。循经组及纳甲组梗死灶体积均较模型组减小，纳甲组差异有统计学意义（P<0.01）。循经组及纳甲组梗死灶体积百分比较模型组降低（P<0.05，P<0.01），2组比较差异无统计学意义（P>0.05）；脑梗死体积百分比较模型组下降（P<0.05）。结果见表2。

2.3 子午流注纳甲法对大鼠血清中神经元特异性烯醇化酶、S100B蛋白含量的影响

与空白组比较，造模大鼠血清中NSE、S100B蛋白含量明显升高（P<0.01）；循经组及纳甲组血清中NSE、S100B蛋白含量较模型组降低（P<0.01），2组比较NSE含量差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。

3 讨论

AIS属中医“中风”范畴，多由于气血逆乱，导致脑脉痹阻或血溢于脑，以昏仆、半身不遂、肢麻、舌蹇等为主要临床表现。有研究表明，AIS发病存在着昼夜节律性差异，并认为导致昼夜发病时间有规律的原因，可用人体生物钟及内环境变化来解释[8]，其发病存在着24 h时间节律差异，上午6-12时发病率较高，其中6-10时为最高时间段，应用圆形分布法分析，其平均发病的高峰时点为8点21分。此时间段加上时差因素正为卯、辰、巳时，当大肠、胃、脾主时；最高时间段正当手足阳明经主时；高峰时点正为辰时，足阳明胃经主时[9]。子午流注针法是按照人体气血虚衰的周期性，从而应对自然界变化，采取逐日按时开穴的针灸治疗方法，突出强调了时间因素对针灸效应的影响，能够起到调和气血、补虚泻实、平衡阴阳的作用。

目前大多数学者认为，缺血性脑损伤后神经元和神经胶质细胞受到损害，大量的胞浆蛋白质漏出细胞进入细胞间液，可溶性的物质通过细胞间液进入脑脊液，穿过破坏的血脑屏障进入血液循环。可以设想，检测血清中与脑损伤有关的生物学物质可用来监测脑卒中的严重程度，了解患者的神经功能恢复情况及治疗效果，并且有可能判断患者的预后。S100蛋白是脑的特异性蛋白，因其表达水平与各种原因引起的脑损伤有紧密联系，已被作为评价脑损伤的一个指标。NSE是神经元损伤最敏感的生化指标，能够反映脑损伤的程度，被认为是神经元损伤的标志酶，且为最灵敏的生化指标，其水平变化能够反映神经元损伤程度及疾病预后[10]。NSE在中枢神经系统中的作用尚未明了，但一些实验研究显示，其具有神经保护作用，而且在中枢神经系统发育过程中参与膜结构形成并参与所有能量依赖性细胞过程[11]。另外，NSE是维持神经元细胞膜兴奋性的必需成分，与应激反应调控有关，具有一定的神经保护作用。检测其在血清中的含量，对脑损伤的早期诊断、判断严重程度及针刺的影响、预后评估具有一定价值。

本实验结果表明，模型大鼠神经功能缺损，梗死侧大脑半球水肿明显，体积明显大于对侧，经TTC染色后，均在梗死侧大脑皮层出现边界清晰、范围恒定的苍白梗死灶，线栓法建立AIS模型的造模方法可靠恒定，与手术创伤无关。AIS模型大鼠经针刺治疗后，一般情况及神经功能明显恢复，梗死灶体积百分比显著下降，脑梗死体积明显缩小，同时降低血清中NSE、S100B蛋白的含量，子午流注纳甲法效果更加显著，优于循经辨证治疗。对AIS模型大鼠进行针刺治疗，可加速脑侧支循环的建立，增加脑血流量，改善脑的氧代谢，保护神经元，减少脑神经元的凋亡，促进神经功能缺损的恢复，减轻缺血后的继发损伤，降低血清中NSE、S100B蛋白的含量，维持了神经元细胞膜兴奋性，减少神经元、胶质细胞等神经系统细胞破坏，降低神经炎性反应，起到神经保护作用，修复被破坏的脑细胞及脑血管，促进损伤的中枢神经细胞修复，重建损伤的血脑屏障，维护血脑屏障正常的通透性，缩小脑梗死体积，起到治疗作用，这可能是针刺治疗AIS患者疗效的机制之一。子午流注纳甲法更能顺应AIS发病昼夜节律性差异与人类的生物钟有关的特点，依“阳日阳时开阳经之穴，阴日阴时开阴经之穴”的原则，于每日辰时或巳时纳甲法按时开穴针刺，因而更利于疾病的治疗。

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（收稿日期：2014-08-02）

（修回日期：2014-08-26；编辑：华强）