益气化瘀方对产后子宫复旧不全大鼠一氧化氮和一氧化氮合酶的影响

张秀丽等

摘要：目的 探讨益气化瘀方促进产后子宫复旧的作用机制。方法 选取50只雌性SD大鼠，采用阴道内注射大肠杆菌制备产后子宫复旧不全模型。按妊娠先后次序编号，随机分为空白组、模型组、新生化组及益气化瘀方低、高剂量组，空白组和模型组灌胃纯净水，益气化瘀方低、高剂量组给予益气化瘀方灌胃，新生化组给予新生化颗粒灌胃，每日1次，连续7 d。HE染色观察子宫内膜形态，硝酸还原酶法检测大鼠血清中一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）的含量。结果 模型组大鼠子宫组织切片HE染色示黏膜下层充血、出血，内膜连续性中断，伴炎性细胞浸润，提示造模成功。模型组NO、NOS含量均高于空白组；与模型组比较，各给药组NO、NOS明显降低（P<0.05，P<0.01）；与新生化组比较，益气化瘀高剂量组NO、NOS降低（P<0.05）。结论 益气化瘀方通过降低NO、NOS水平，抑制子宫螺旋动脉异常舒张，促进子宫内膜的重建与修复。

关键词：子宫复旧不全；益气化瘀方；一氧化氮；一氧化氮合酶；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0058-03

产后，子宫通过肌肉收缩缩复、肌细胞自溶、内膜增生、血管修复等过程，恢复至非孕时的状态，称子宫复旧。如果子宫体平滑肌纤维没有如期收缩缩复、胎盘胎膜未能及时剥脱顺利排出、子宫内膜再生修复障碍，则发展为子宫复旧不全[1]。益气化瘀方是湖南中医药大学尤昭玲教授治疗人工流产、药物流产、产后恶露不绝、腹痛的常用经验方，临床疗效好。前期我们研究了其对激素水平、炎症因子、胶原降解、血管再生的影响[2-4]。一氧化氮（NO）是一种血管舒张因子和血小板凝集抑制剂，一氧化氮合酶（NOS）是其合成的限速酶，它们可能参与调节子宫血流和子宫内膜的重建与修复[5]。为进一步研究益气化瘀方对产后子宫复旧不全的干预机制，本研究观察益气化瘀方对产后子宫复旧不全大鼠血清中NO、NOS的影响，探讨其促进产后子宫复旧的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性SD大鼠50只，雄性大鼠20只，鼠龄<3个月，清洁级，体质量（200.4±8.1）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2011-0003，饲养于SPF级实验室。

1.2 药物

益气化瘀方（党参、蒲黄、黄芪、茜草等），临床用量为52 g/d，益气化瘀方低剂量组（4.68 g/kg）为临床用量，益气化瘀方高剂量组（9.36 g/kg）相当于临床用量2倍，湖南中医药大学第一附属医院提供；新生化颗粒，云南白药集团股份有限公司生产，临床用量为24 g/d，批号ZLB1304。

1.3 主要试剂与仪器

NO、NOS测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20120624）。MK3型酶标仪，热电（上海）仪器有限公司生产。

1.4 菌种

临床分离致病性大肠杆菌（X25922），湖南中医药大学微生物研究室提供。

1.5 分组、造模与给药

大鼠随机分为空白组、模型组、新生化组及益气化瘀方低、高剂量组（益气低、高组），每组8只。大鼠常规喂养1周后，晚8：00将雌鼠、雄鼠以2∶1比例合笼，第2日清晨阴道口查找阴道栓。如发现阴道栓确定为妊娠第1日。若未见阴道栓，则行阴道冲洗液涂片找精子，发现精子的当日为妊娠第1日。妊娠大鼠分笼饲养至自然分娩。分娩后第1日，将过夜培养的大肠杆菌用生理盐水稀释成1.0×107个/mL，进行宫腔内接种，每只大鼠接种量为0.2 mL[6]。造模后第1日开始，益气低、高组分别给予益气化瘀方4.68、9.36 g/kg灌胃，新生化组给予新生化颗粒2.16 g/kg灌胃，灌胃体积为8 mL/（kg·d），模型组和空白组灌胃等量白开水。每日1次，连续7 d。

1.6 指标检测

1.6.1 HE染色观察子宫内膜形态 各组大鼠于末次灌胃后2 h，腹腔注射20%乌拉坦麻醉，腹主动脉采血后，脱颈处死。取出单侧子宫长约2 cm，4%福尔马林固定24 h，不同浓度乙醇依次脱水，二甲苯透明40 min，软蜡中浸1 h，石蜡包埋，冷冻12 h后，连续冠状切片（4 mm），常规HE染色，封片，镜下观察子宫内膜变化。

1.6.2 血清一氧化氮、一氧化氮合酶含量测定 腹主动脉采血，室温下静置60 min，离心10 min，留取上层血清，按照试剂盒说明书操作，应用硝酸还原酶法，测定大鼠血清中NO、NOS含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS18.0 统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，符合正态性和方差齐性的数据行方差分析，样本间两两比较采用q检验，不符合上述条件用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益气化瘀方对大鼠子宫内膜形态学的影响

空白组大鼠子宫内膜上皮细胞轻度脱落，偶见内膜连续性部分中断，腺体数目少；模型组有炎细胞浸润，间质疏松水肿，部分上皮细胞坏死脱落，内膜连续性部分中断，内膜下小血管扩张、充血、出血；新生化组及益气高组内膜上皮损伤较轻，炎细胞少见，内膜连续性好，腺体数目多，血管未见明显扩张，间质较致密，宫腔中渗液不明显；益气低组上皮损伤介于模型组与益气高组之间。见图1。

2.2 益气化瘀方对大鼠血清中一氧化氮、一氧化氮合酶的影响

与空白组比较，模型大鼠血清中NO、NOS含量升高；与模型组比较，各给药组均能明显降低模型大鼠血清中NO、NOS水平，且益气高组效果优于新生化组。见表1。

3 讨论

产后子宫复旧是一个复杂的过程，子宫收缩、胎盘或胎膜排出、胶原降解、细胞凋亡、内膜增生，血管修复贯穿始终，甾体激素及其受体、血管活性物质、炎症因子等共同调控这一过程。分娩后，子宫内膜损伤主要通过内膜增生和血管再生来修复。

NO是一种血管舒张因子，具有广泛生物学效应，适量NO参与人体正常生理功能，过多NO可引起细胞毒性作用，导致组织损伤。NO还能强烈抑制血小板聚集，从而防止血栓形成。强缩血管物质与舒血管物质NO共同作用于子宫螺旋动脉，导致其节律性收缩与舒张。NO还能直接扩张子宫内膜血管平滑肌、抑制子宫肌层收缩，调节子宫血流、重建并修复内膜。因而，同时兼具血管舒张因子和血小板凝集抑制剂双重作用的NO，参与调节子宫出血及止血。

NOS是NO合成的限速酶，主要存在于人体正常子宫内膜的表面上皮、腺上皮及血管内皮，是女性生殖过程中主要的旁分泌介质和重要的生物调节剂，还参与了子宫出血的调控。NOS有3种亚型，即神经元型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS）。eNOS与nNOS在生理状态下持续表达，iNOS是病理状态的酶，生理状态下不表达，当机体出现炎症、免疫反应时，催化产生大量的NO，而过量的NO使子宫螺旋动脉异常舒张，血管修复障碍。

NO-iNOS系统参与女性生殖生理活动，如子宫内膜周期性变化的调节、细胞凋亡、卵泡发育、卵巢性激素的分泌、胚胎着床、妊娠与分娩及平滑肌的增殖分化等。月经来潮过程中，它参与了子宫内膜的增殖、剥脱。分娩后，它还可以稳定溶酶体膜、对抗氧自由基对血管内皮的损伤。

产后宫腔注入大肠杆菌可导致产后子宫内膜炎影响子宫复旧，我们的前期研究表明，模型大鼠产后白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α异常高表达[3]。异常升高的炎症因子如白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α等刺激iNOS，导致其含量异常增高。高含量的iNOS导致大量NO产生，诱发子宫螺旋动脉过度舒张，局部血流增快，血浆渗出增多，组织水肿，内膜修复障碍，导致子宫出血淋漓不净。产褥期女性处于特殊的生理时期，产时亡血伤津，元气受损，产后多虚易瘀，其中以气虚为本，以血瘀为标，以标实为急，治宜益气化瘀为主。本实验结果表明，模型大鼠血清NO、NOS含量升高。益气化瘀方和新生化颗粒均能明显降低模型大鼠血清中NO、NOS水平，且高剂量益气化瘀方优于新生化颗粒。我们推测益气化瘀方的作用机制可能有以下几点：①抑制子宫内膜细胞中NOS的表达，减少NO合成，抑制子宫螺旋动脉过度舒张，减少炎症渗出；②降低NO含量，间接降低前列腺素的合成和含量，抑制血小板聚集、抑制血栓形成；③提高溶酶体膜的稳定性，对抗血管内皮的损伤，重塑子宫螺旋动脉，促进内膜血管平滑肌及血管收缩，调节子宫血流，参与内膜重建修复。

参考文献：

[1] 杜惠兰.中西医结合妇产科学[M].北京：中国中医药出版社，2012：87- 89.

[2] 尤昭玲，曾晶，游卉，等.妇科止血消痛颗粒对药物流产大鼠模型雌孕激素及其受体的影响[J].中国中医药信息杂志，2010，17（8）：19-21.

[3] 邓海燕，曾晶，查亚萍，等.益气化瘀方对产后子宫复旧不全模型大鼠TNF-α，IL-1，6-K-PGF1α，TXB2的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011， 17（10）：196-198.

[4] 曾晶，尤昭玲，查亚萍，等.妇科止血消痛颗粒对产后子宫复旧不全大鼠模型子宫MMP-9、TIMP-1 mRNA表达的影响[J].中国中医药信息杂志， 2011，17（6）：31-33.

[5] 尤昭玲，丁青.三七复合有效成分对子宫内膜炎症细胞一氧化氮及一氧化氮合酶的影响[J]，中国中医药科技，2007，14（2）：115-117.

[6] 赵红琼，简子健，姚刚，等.建立大鼠实验性子宫内膜炎模型的探讨[J].新疆农业大学学报，2008，31（3）：5-8.

（收稿日期：2014-10-18；编辑：华强）