1 138例HPV分型检测结果的分析研究

崔辰莹 张岸平

人乳头状瘤病毒(human papillomavirius，HPV)是嗜上皮病毒的一种，它包含了大概8 000个碱基对，具有种属特异性，属双链闭环的小DNA病毒。在临床中我们发现，患者在HPV感染以后，被感染的细胞会过度增殖，并且产生恶性的转化。近年来的研究表明[1]，许多人类恶性肿瘤的发生、发展与HPV感染有着密切关系。流行病学和基础研究证明HPV感染是子宫颈癌的主要病因，95%的宫颈癌标本可以检测到HPV[2]。本文通过对1 138例标本HPV分型检测结果的分析，了解秦皇岛地区女性高危型HPV感染特点及HPV感染与宫颈病变之间的关系，为早期防治宫颈癌及癌前病变提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 标本来源 2012-10—2014-10在秦皇岛市第一医院妇产科门诊就诊及住院治疗的宫颈炎、阴道炎、宫颈癌及疑似患者标本1 138例；年龄16～75岁，平均41岁。

1.2 标本采集 用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，将宫颈刷伸入宫颈处，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转3～5圈，慢慢取出宫颈刷，将其放入装有专用细胞保存液的样本管中，送检标本，若送检样本不能马上检测的于4℃保存，并在一周内完成检测。

1.3 检测方法

1.3.1 DAN提取 临床标本经过振荡混匀后，从管底部吸取500μL标本，以14 000 r/min离心1 min，把上清液去掉，利用凯普生物化学科技公司生产的基因组提取试剂盒进行HPV-DAN提取。

1.3.2 PCR扩增 取1μL提取好的DNA样本作为模板进行PCR扩增，20℃ 10 min，95℃ 9 min；95℃ 20 min，55℃ 30 min，72℃ 30 min，做40个循环；在72℃ 5 min后，放置于4℃保存。

1.3.3 导流杂交 利用HybriMax核酸分子快速杂交仪进行导流杂交：在95℃把25μL的PCR产物加热5 min，然后立即冰水浴至少2 min，进行变性；将已变性DNA样品加入0.5 mL预热至45℃的杂交液，在导流杂交仪上45℃温育10 min后进行导流杂交，杂交后再用0.8 mL杂交液冲洗膜3次；在25℃用0.5 mL封阻液封闭膜5 min；去除阻液封，加入0.5 mL酶标液温浴3.5 min；用0.8 mL缓冲液A冲洗杂交膜4次，加入0.5 mL NBT/BCIP溶液，显色3～5 min；用0.8 mL溶液B洗膜3次，再用0.8 mL蒸馏水冲洗膜，取出杂交膜在1 h内分析结果。

1.4 结果判断 通过肉眼观察显色情况来判断结果，清晰可见的蓝紫色圆点为阳性点，根据膜条HPV分型分布图判断阳性点为何种HPV亚型(图1～2)。

1.5 统计学分析 使用SPSS 14.0软件做统计学处理，应用χ2检验，把P＜0.05作为差异有统计学意义的标准。对于多重感染患者，重复计算各基因型阳性率。

2 结果

2.1 HPV分型及亚型 本实验共检测了1 138例病例，阳性438例(高危低危混合感染按型别重复计数)，总检出率为38.49%；高危型393例(包括单纯高危型360例和高危低危混合感染33例)，检出率34.53%；低危型78例(包括单纯低危型45例和高危低危混合感染33例)，检出率6.85%；共检测出20种HPV亚型(表1)。

2.2 高危型HPV的检出率 高危型HPV的检出率随宫颈病变的进展而增加，宫颈炎组15.96%、CINⅠ组39.85%、CINⅡ组90.63%、CINⅢ组92.54%、宫颈癌组100%。各组之间差异有统计学意义(P＜0.05，表2)。

2.3 高危型HPV多重感染检出率 本实验研究结果显示高危型HPV单一感染313例，检出率79.64%，多重感染80例，检出率20.36%(表3)。随着宫颈病变级别增高，高危型HPV多重感染检出率也增高，宫颈炎组为27.14%，CINⅠ组为35.90%，CINⅡ组为39.04%，CINⅢ组为50.00%，宫颈癌组为60.87%。各组之间差异有统计学意义(P＜0.05，表4)。

图1 HPV高危型

图2 HPV低危型

表1 438例阳性标本中HPV亚型检出率的比较

表2 宫颈各级病变中高危型HPV检出率的比较(n)

表3 393例高危型HPV感染者的多重感染检出率

表4 宫颈各级病变中HPV多重感染检出率

3 讨论

宫颈癌在世界范围内，是一种常见的妇科恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，属于女性第二大肿瘤。据统计，全球每年约有27万妇女死于宫颈癌，其中有80%也就是近22万的患者是在发展中国家[3]。相关数据显示，中国每年大约能有13.5万的新发现病例，这个数据占世界宫颈癌新发病例总数的28.8%，还出现了同一地区数量剧增和发病年龄越来越年轻的现象[4-5]。已有研究证实[6-8]，患者罹患子宫颈癌的最主要的根源，就是高危型人乳头状瘤病毒持续感染。

通过考证近年来关于宫颈癌病因学的诸多研究，发现HPV感染与宫颈癌前病变、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及宫颈癌的发生关系密切。研究发现，在全球范围内，宫颈癌组织中有99.7%都能够检测到高危型HPV DNA[9]。从流行病学的调查资料中我们可以得到以下信息：HPV和宫颈癌前病变或者是和宫颈癌之间具有的相对危险度(RR)是20～70，证明两者之间有很好的关联程度，这种高关联度甚至超过了吸烟和肺癌之间的关系。

中日友好医院[10]曾经用基因芯片导流杂交技术对宫颈病变进行HPV DNA检测，在被检测的448例病例中，发现HPV多重感染检出率为44.4%，主要集中在16、52、58和18，同时发现，随着病变的加重，HPV多重感染检出率就会相应地增多。本调查结果显示秦皇岛地区的单一感染313例，检出率79.64%，多重感染80例，检出率20.36%。多重感染检出率略高于Cai等[11]报道的11%。有学者指出，在HPV多重感染中HPV16型是作为最常见的基因型出现的，而且多重感染中也常有HPV16、18、33型的出现，认为HPV基因型可能是造成HPV的多重感染的原因[12]。而且随着宫颈病变级别增高，高危型HPV的多重感染检出率也增高。Lee等[13]的研究发现，如果感染单一型别HPV，患宫颈癌的风险会增加19.9倍，但是，如果感染HPV多重型别，患宫颈癌的风险将增加至31.8倍。

根据国内外大多数学者的意见，35岁被作为宫颈癌的年龄划分界线，35岁以下的妇女发生的宫颈癌被我们称为年轻妇女宫颈癌[14-16]，年轻宫颈癌患者的病变具有更高的恶性程度及高比例的非鳞癌化、更容易发生早期的转移并且预后比较差，年生存率短[17]。因此妇女如果能够定期有效的做HPV筛查，并能做到持续监测，尤其是年轻妇女这个群体要被特别关注，那么，早预防、早发现、早治疗才能真正的被实现，对于宫颈病变的女性患者来说，这对于提高她们的生活质量有着深远影响。

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