真菌和哺乳动物GPI锚定蛋白结构和功能差异的研究进展

牛理达 赵静 吴建华

(第二军医大学附属长海医院皮肤科，上海200433)

在真核生物体内有两种类型的膜蛋白:完整的膜蛋白和脂质锚定蛋白。完整的膜蛋白包括一个或几个跨膜区域，从而构成疏水的α-螺旋结构，将蛋白嵌入流动的双分子层中［1］。我们将脂质锚定蛋白分为两组:一组是将蛋白连于内部的质膜侧，其余的则连于外侧。第1组以钙调磷酸酶B为代表，第2组则是一些包含C-末端信号序列的蛋白通过GPI锚连于细胞膜上。GPI锚定蛋白 (Glycosylphosphatidylionsitol-anchored protein，GPI-anchored protein)是在真核生物中的一种保守的翻译后修饰蛋白，如真菌中白念珠菌的GPI锚定蛋白对真菌细胞壁的合成和修复，氧化应激的适应以及对机体的侵袭等发挥着重要作用;而在哺乳动物体内GPI锚定蛋白的合成贯穿于胚胎发育、神经发生、免疫反应和受精作用。若GPI锚定蛋白的生物合成途径受损，将会导致一些疾病的发生，严重者会导致胚胎致死。

1 GPI锚定蛋白的结构、修饰和转运

在真菌细胞内的GPI锚定蛋白的N端和C端均有信号肽，其中C末端为可以有效诱导其与GPI锚结合，故称为GPI锚定蛋白的锚定信号肽，一般为一段不带电的疏水性的氨基己酸，在靠近C末端9-10氨基酸的位置有GPI结合位点ω点。蛋白中间由功能集团和富含色氨酸/丝氨酸的结构区域构成。N短信号肽、C端疏水性氨基酸以及靠近C端的ω点被认为是GPI锚定蛋白的保守结构域 (见图1)。

以啤酒酵母菌为代表来详细描述一下真菌GPI锚定蛋白 (GPI-anchored proteins，GPI-APs)的修饰与转运。在GPI锚与蛋白相连后，与肌醇相联的酰基链被 Bst1p移除 (PGAP1的同源物)［2］，脂肪酸的移除且被转运至内质网上是由Per1p(哺乳动物体内的PGAP3同源物)介导和Gup1p调节的［3］。Ted1p和Cdc1p是哺乳动物中PGAP5的同源物，定植于内质网上。有报道指出，Ted1p对GPI锚上的乙醇胺-磷酸盐(Ethanolamine phosphate，Et-NPs)起作用，单链的 EtNPs是在 Mcd4p和Gpi7p的作用下添加上去的，而EtNPs是否也在它们的作用下被移除还不得而知［4］。GPI-APs包含一个长饱和脂肪酸，以脂肪依赖的方式将特定的蛋白集中和分类至特定的内质网出口(ER-exit site，ERES)。P24蛋白家族通过在ERES特定的区域与COPII连接促进修饰后的 GPI-APs有效输出［5］。GPIAPS在运至高尔基体后与P24蛋白复合物家族发生接力，未发生修饰的GPI-APs被P24蛋白复合物通过CPOI由高尔基体回运至内质网 (见图2)。内质网上合成的GPI-APS以不同的形式转运至真菌或酵母的细胞壁或细胞膜上。

2 真菌细胞壁GPI锚定蛋白的结构和功能

真菌的细胞壁GPI锚定蛋白 (cell wall GPI-anchored proteins，GPI-CWPs)常常高度的磷酸化和糖基化，并且常常参与带正电离子的绑定［6-7］。蛋白外衣由 β-1、6-葡聚糖、β-1、3-葡聚糖和少量甲壳素构成的内层的多聚糖层包围［8］。GPI-CWPs在外层的蛋白外衣通过GPI锚以共价键的方式与β-1，6糖苷键相连，同时依次与 β-1，3-葡聚糖的分子末端相连 (见图3)。

真菌细胞壁上的GPI锚定蛋白对真菌的黏附、形态转换和细胞壁合成有着重要的影响，以白念珠菌为例，白念珠菌中的GPI锚定蛋白具有呈家族性出现的特征，通过对白念珠菌全基因组序列的对比，发现有白念珠菌中的115个GPI锚定蛋白的编码基因中有67个分别属于不同的基因家族。白念珠菌70%的GPI锚定蛋白的功能未知，但是他们在合成和维持细胞壁的完整及侵袭方面有着重要的作用，例如白念珠菌SC5314中的ALS家族中的8个成员介导了白念珠菌与宿主细胞的黏附［9-10］。Als3，作为一种侵袭素促进白念珠菌被宿主上皮细胞摄取［11］，同时在结合铁蛋白螯合铁方面起到重要作用。菌丝相关性的Hwp1在介导菌丝形成方面发挥重要作用，进而影响真菌的黏附和侵袭［12］。其他GPI-CWPs在细胞壁的合成和修饰方面也发挥作用，例如 Gas/Phr家族［13-14］、Crh家族和Ecm33家族。GPI锚定的天门冬氨酰蛋白酶或天冬酶sap9和sap10也有助于真菌细胞壁的合成［15］。过氧化物歧化酶 Sod4、Sod5和Sod6被预测有潜在的侵袭属性［15-17］。微生物的黏附是其致病性最重要的决定因素之一，真菌病原体被确定的黏附素很少，来自于白念珠菌的Hwp1、Ala1p/Als5、Als1p和来自于光滑念珠菌的Epa1，他们都隶属于糖基磷脂酰肌醇依赖的细胞壁蛋白 (GPI-CWP)［18］，在介导真菌与宿主细胞之间的黏附过程中发挥重要作用。

3 哺乳动物GPI锚定蛋白的概述以及与真菌GPI锚定蛋白的区别与联系

GPI锚存在于每一个真核生物体内，从单核的酵母细胞、一些浮游生物的细胞到高级的哺乳动物的细胞，然而很多GPI锚定蛋白如葡糖苷酶、α-淀粉酶、天门冬氨酰酶、超氧化物歧化酶、磷脂酶等的特定功能都无从知晓，在哺乳动物体内GPI锚的合成与真菌具有相同的方式，由胆胺、甘露糖、葡糖胺和肌醇在内质网上合成以分泌的形式转运至细胞膜表面，形成 GPI质膜蛋白 (Plasma membrance GPI proteins，GPI-PMPs)(见图 4)，而在真菌体内GPI锚定蛋白除了可以锚定于细胞膜外，其中部分蛋白可以从细胞膜上脱落，而以共价键的方式与细胞壁上的β-1，6-葡糖胺相结合，形成细胞壁GPI锚定蛋白 (cell wall GPI-anchored proteins，GPICWPs)，哺乳动物GPI-APs是哺乳动物胚胎发育、神经发育、免疫反应和受精所必需的，人类的一些疾病就是由于GPI锚定蛋白合成过程中的基因突变造成的。有研究指出，在造血干细胞中，PGI-A编码了GPI锚生物合成的第一种酶，PGI-A主干的突变与阵发性血红蛋白尿 (PNH)，一种获得性的溶血性疾病的发生有重要关联，此外还有一些报道指出PIG-M、PIG-V和PIG-N的常染色体隐性突变会引起遗传性的GPI锚定蛋白缺陷［19］，从而造成身体发育过程中严重的缺陷，由此我们可知哺乳动物和真菌的GPI锚定蛋白的结构和功能具有很大差异，但是将他们连于细胞壁或者细胞膜上GPI锚的合成和核心结构是相似的。

4 展 望

真菌的GPI锚定蛋白是细胞免疫和体液免疫重要的目标，随着近年来关于白念珠菌GPI锚定蛋白的研究越来越多，研究人员不再仅仅着眼于某一个蛋白，而是从整体角度、基因家族角度去研究GPI锚定蛋白的结构和功能。此外，以GPI锚定蛋白为靶点，筛选出新的新的抗真菌药物的工作也成为研究方向，一些推测的如葡聚糖Blg2，Camp65/Scwl和黏附因子Als1和Als3，在白念珠菌病的动物模型中利用后3种GPI锚定蛋白可预测研制出疫苗［20］。而在哺乳动物体内GPI锚定蛋白功能广泛，涉及细胞识别、信号转导、生长发育、分化和程序性死亡等重要生命过程，与许多疾病有着一定的联系，如血栓形成、白血病等［21］。由于真菌和哺乳动物的GPI锚具有相似的合成部位和核心结构，在研发作用于GPI锚定蛋白的抗真菌药过程中，虽然抗真菌GPI锚定蛋白的药物具有较好的种属特异性，因此我们推测对于真菌GPI锚定蛋白的损伤有可能会间接影响都真菌GPI锚的功能进而可能会引起一些无法预测的药物的副作用。同时通过对真菌细胞壁蛋白组结构的调整和动态修饰的研究，在真菌感染宿主时，我们可以了解细胞壁成分对于宿主识别病原体中的作用。同时有利于我们研发新的疫苗、生物标记物等，进而帮助我们提高一些致病性真菌的诊断和治疗。

图1 GPI锚定蛋白(Glycosylphosphatidylionsitol-anchored protein)核心结构的示意图［20］ 图2 啤酒酵母菌细胞壁上GPI锚定蛋白的修饰与转运示意图［19］ 图3 GPI锚定蛋白与真菌细胞壁的连接方式示意图［20］ 图4 真核生物质膜GPI锚定蛋白和细胞壁GPI锚定蛋白的位置和结构示意图［1］Fig.1 The nuclear structure of Glycosylphosphatidylionsitol-anchored protein Fig.2 The modification and transfer of GPI-anchored proteins on Saccharomyces cerevisiae＇s cell wall Fig.3 The connection of between GPI-anchored protein and cell wall in fungi Fig.4 The location and structure between Plasma membrane GPI proteins and Cell wall GPI proteins in eukaryotic cells

综上所述，不论在真菌还是在哺乳动物体内，GPI锚定蛋白作为重要的细胞表面蛋白，显示出了重要的研究意义，也开始受到研究人员越来多的关注。

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