靶向金纳米棒对隐球菌活性影响的体外实验研究

肖琴 陈敏 徐楠

(1.同济大学附属东方医院皮肤科，上海200120;2.上海市长征医院皮肤科，上海 200003;3.上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海200003)

隐球菌病是一种严重的深部真菌病，由于隐球菌具有嗜中枢神经性，感染通常侵犯中枢神经系统，死亡率较高［1］。

作为一线抗隐球菌药物的两性霉素，通常需要辅助鞘内注射，同时副作用大，长期应用患者很难耐受［2］。而氟康唑、伊曲康唑等新型药物虽然能部分通过血脑屏障，但存在一定的耐药性，治疗效果欠佳［3-4］。近红外激光对人体组织的穿透性较好，但是对组织的损伤相对较轻［5］。金纳米能够吸收近红外区域波长(700～1000nm)，具有良好的生物兼容性，低毒性，出色的光稳定性，具备光热转换功能，使得金纳米棒成为了光热治疗的良好介质［6］。近年来关于 GNP光热疗法 (photothermal therapy)在肿瘤及感染性疾病的治疗研究越来越多［7］。Laura等［8］用 HER2 抗体标记的 GNP-HER2与过度表达HER2的乳腺癌细胞株共孵特异性结合，进行光热治疗，发现能特异性结合GNP-HER2的细胞株在NIR照射区域出现了明显的细胞结构破坏和细胞凋亡。Peng Huang等［9］将 GNP-FA(叶酸)与能与FA特异性结合的胃癌细胞系MCG-803共同孵育后接受NIR照射，实验组细胞结果破坏甚至细胞凋亡。

本研究中，我们用隐球菌的荚膜抗体特异性标记GNP，尝试体外介导光热治疗，为进一步的体内实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 新生隐球菌H99(第二军医大学长征医院皮肤病与真菌病研究所馈赠)。

实验材料 隐球菌荚膜抗体Anti-Cryptococcus neoformans antibody(美国Abcam公司);细胞活性检测试剂盒Celltiter-GloLuminescent Cell Viability Assay(美国Promega公司);四氯金酸Chloroauric acid(HAuCl4·3H2O)，十六烷基三甲基溴化铵cetyltrimethylammonium bromide(CTAB)，硼氢化钠sodium borohydride(NaBH4)，硝酸银 silver nitrate(AgNO3)，正 硅 酸 乙 酯 tetraethylorthosilicate(TEOS)，3-氨丙基三乙氧基硅烷3-aminopropyltrimethoxysilane(APTS)购自中国，J＆K Chemical Limited。聚苯乙烯磺酸钠［PSS，Poly(sodium-4-styrenesulfonate)］、抗坏血酸购自国药集团化学试剂有限公司。

实验仪器Shimadzu UV-2450紫外光-可见光光度仪(江苏省科学器材有限公司)，红外激光器(型号LWIRL 808，北京镭志威光电技术有限公司)，120KV生物型透射电镜(型号Tecnai G2 spirit Biotwin，FEI公司)，GloMax 96微孔板发光检测仪(Promega公司)。

1.2 方法

晶种生长法制备金纳米棒 本实验采用晶种生长法制备金纳米棒［9-11］，主要有以下步骤:

金晶种子的制备:用 0.1 mol/L的 CTAB 7.5 mL及10 mmol/L 的 HAuCl40.25 mL，制备金晶种子。制备的金晶种子室温放置2 h后备用。

金纳米棒的制备:0.1 mol/L的 CTAB 100 mL，10 mmol/L的HAuCl45 mL，搅拌均匀后依次加入 10 mmol/L 的 AgNO31.5 mL，0.5 mol/L 的H2SO41 mL，0.1 mol/L 的抗坏血酸 0.8 mL，金晶种子0.24 mL，搅拌混匀室温放置24 h，待金纳米棒生长终止。

金纳米棒的表面改性与修饰:(1)椭球形二氧化硅包覆的金纳米棒 (GNP@SiO2)的制备。(2)氨基化修饰。(3)聚苯乙烯磺酸钠对氨基化修饰后的金纳米棒的表面包覆(PSS-GNP@SiO2)取上述10 mL氨基化修饰的金纳米棒溶液，并加入2 mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠 (PSS，MW≈70 000 g/mol)溶液 (其中含6 mmol/L的NaCl)10 mL，剧烈搅拌2 h后，离心 (12 000 r/min)收集并分散于5 mL纯水中，得到聚苯乙烯磺酸钠包覆的金纳米棒(PSS-GNP@SiO2)。

金纳米棒与隐球菌荚膜抗体的偶联 取上述改性成功的金纳米棒溶液2.5 mL与100μg隐球菌荚膜抗体在37℃条件下搅拌混匀3 h，抗体与PSS通过疏水作用相结合，然后离心(12 000 r/min)收集得到最终的金纳米棒探针。抗体为对新生隐球菌特异性抗体，合成GNP-Ab。

GNP与GNP-Ab的体外表征 生物型透射电镜观察(TEM)检测GNP和GNP-Ab粒子的大小、形状及均匀性。具体操作如下:移液器将约40μL待测样品液体滴至铜网上，室温下自然干燥后置于电镜下观测。

紫外光-可见光光度仪对GNP、GNP-Ab及隐球菌荚膜抗体Ab进行紫外-可见光吸收谱分析，光的路径长度为1 cm，检测光谱波长范围为200～1 000 nm。将需要检测的样品0.7 mL置于比色皿中行吸收光谱分析。

隐球菌与GNP及GNP-Ab连接 隐球菌悬液准备 (1)菌种保存于-80℃冰箱中，无菌棉签刮取少量冰屑于提前准备好的YPD液体培养基中，置于摇床孵育18 h(150 r/min 37℃)。(2)停止摇床，离心 (2 000 r/min 3 min)，取沉淀，四区划线接种于SDA固体培养基中，37℃孵育48 h。(3)取单克隆菌落加入2 mL无菌PBS中，清洗细胞3次，并用PBS溶液重悬菌细胞，用血细胞计数板制成107/mL的菌悬液。

菌体靶向金纳米棒共孵育 (1)取一12孔板，各孔中依次加入菌悬液1 mL，再加入浓度为4 mg/mL GNP-Ab 1 mL，混匀后37℃避光孵育。(2)1 h后将96孔板中的菌悬液转移至1.5 mL EP管中，离心 (2 000 r/min 5 min)，去上清，分别收集孵育后的细胞，收集6孔，作为副孔。并用PBS液清洗3次，PBS重悬细胞至总体积为1 mL，用作后续的实验。

体外光热治疗 将“隐球菌与GNP及GNP-Ab连接”中获得的孵育后的隐球菌悬液细胞及不经任何处理的隐球菌细胞悬液，接受近红外激光照射，近红外照射的中心波长为808 nm，输出功率为4 W/cm2，持续时间5 min，垂直距离10 cm。受激光照射的细胞在37℃下孵育2 h，PBS液清洗3次后，使用Promega CellTiter-Glo萤光细胞活性检测试剂盒对收获的细胞进行ATP含量的检测，计算隐球菌细胞活性下降程度，严格按照试剂盒的实验步骤进行操作［12］。具体分组如下:①隐球菌细胞悬液未经处理 (NC)。②隐球菌细胞悬液仅接受近红外照射 (NCN)。③隐球菌细胞悬液与特异性GNP-Ab孵育1 h后接受近红外照射 (NCAbN)。上述分组中，隐球菌细胞的含量为1×106个。

1.3 统计分析

步骤“体外光热治疗”中获得的不同处理方式的隐球菌细胞活性数据，计量资料以(珋x±s)表示，采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两间的比较采用对比检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 金纳米棒的合成及其表征

制备的金纳米棒颗粒大小一致，分布均匀，性状稳定。颗粒的横径和长径分别为 (18.48±2.39)nm，(57.56±4.57)nm(见图 1)。GNP 与抗体偶联后并不改变其颗粒的形态、大小及长径和横径 (见图2)。紫外-可见光吸收光谱图 (见图3)显示，GNP在520 nm及808 nm附近均出现了吸收峰，GNP-Ab在540 nm和830 nm附近出现了吸收峰。而隐球菌荚膜抗体与GNP-Ab在280 nm出现了吸收峰。

2.2 体外GNP-Ab光热治疗效应对隐球菌活性影响

隐球菌细胞悬液与GNP-Ab共孵育后，接受NIR照射后的隐球菌细胞的ATP酶活性的变化，而其变化代表了细胞活性变化。3组不同处理方式隐球菌细胞活性检测结果行单因素方差分析，结果显示3组之间细胞活性差异有统计学意义(F=26.193，P＜0.05)。对比检验两两比较中，隐球菌细胞未经处理 (NC)的活性 (1 880 100±817 729，n=6)比隐球菌细胞仅接受近红外照射 (NCN)高(366 329±108 561，n=6)，对比值 1 513 800，P＜0.05;隐球菌细胞仅接受近红外照射 (NCN)的细胞活性 (366 330±108 561，n=6)较隐球菌细胞与特异性GNP-Ab孵育1 h后接受近红外照射(NCAbN)(4 353±1 028)高，对比值 361 976，P＜0.05。不同的处理方式后隐球菌细胞活性的变化见图 4～5。

图1 GNP透射电镜扫描图 图2 GNP连接抗体(GNP-Ab)的透射电镜扫描图 图3 GNP、GNP-Ab、Ab的紫外线-可见光吸收光谱图，红色曲线为GNP，黑色曲线为GNP-Ab，蓝色曲线为抗隐球菌抗体 图4 隐球菌细胞活性OD值比较。NC.为隐球菌细胞悬液未经任何处理，NCN.隐球菌悬液仅接受近红外照射，NCABN.隐球菌悬液与特异性GNP-Ab孵育1 h后接受近红外照射 图5 隐球菌细胞活性变化的趋势比较。NC.隐球菌细胞悬液未经处理，NCN.隐球菌悬液仅接受近红外照射，NCABN.隐球菌悬液与特异性GNP-Ab孵育1 h后接受近红外照射Fig.1 TEM imagine of GNP Fig.2 TEM imagine of GNP conjugated with anti-Cryptococcus neoformans antibody Fig.3 UV-vis spectrum of the GNP，GNP-Ab and Ab.the bule curve is anti-Cryptococcusneoformans antibody;the red curve is GNP;the black curve is GNP-Ab Fig.4 Cell viability of cells with different treatments;NC is cells without incubation and NIR irradiation;NCN is cells without incubation，just with NIR irradiation;NCABN is cells incubated with GNP-Ab suspension，then with NIR irradiation Fig.5 The tendency of variation of cells with different treatments;NC is cells without incubation and NIR irradiation;NCN is cells without incubation，just with NIR irradiation;NCABN is cells incubated with GNP-Ab suspension，then with NIR irradiation

3 讨 论

晶种生长法是目前制备金纳米棒的众多方法中应用最广的一种［10-11］。其基本原理是在反应液中加入一定量的金纳米颗粒晶种子 (约2～5 nm)，在表面活性剂分子以及还原剂的共同作用下，晶种颗粒定向生长为一定长径比的金或银纳米棒。通过改变反应体系中的晶种子及还原剂的量、溶液的pH值以反应物的浓度可以调节纳米棒的长径比。金纳米棒的表面等离子吸收峰有两个，一个是位于弱短波长的吸收峰位于520 nm附近，这个吸收峰的出现主要是因为横向电子震荡;还有一个强长波长吸收峰位于可见光至近红外的范围内，这个吸收峰的出现主要是因为电子的纵向震动，且与金纳米棒的长径比有关系［13-14］。本实验结果显示 GNPAb在540 nm及830 nm附近均出现了吸收峰，与GNP比较两个吸收峰均发生了外移。外移是由于GNP-Ab外面的一系列修饰，如被覆二氧化硅、连接抗体等使得GNP周围环境的折射率增大而导致。结合TEM图像证明纳米棒成功合成。此外，GNP-Ab在280 nm处也出现了吸收峰，而抗体作为蛋白质其吸收峰为280 nm，据此GNP-Ab在280 nm吸收峰是由于与抗体的偶联而产生的，说明抗体与金纳米棒颗粒成功偶联 (见图3)。以上结果均证明我们已经成功合成针对隐球菌的靶向性金纳米棒。

隐球菌细胞活性检测实验结果显示，隐球菌接受NIR照射后，细胞活性下降，这说明隐球菌对光热治疗敏感。NIR照射能够清除部分的隐球菌;隐球菌与靶向性金纳米棒连接后再接受NIR照射，其活性比仅接受 NIR照射明显下降，这说明靶向性的GNP-Ab增强了NIR对隐球菌的杀伤力，提示在与靶向性GNP-Ab特异性结合后，隐球菌对光热效应的敏感性明显上升。隐球菌细胞活性下降的原因，目前尚不清楚。Norman等［15］将金纳米棒与绿脓杆菌特异性抗体共价结合后，接受NIR照射后，绿脓杆菌的细胞活性明显下降。接受照射后的绿脓杆菌进行TEM检测，发现绿脓杆菌的细胞膜出现不可逆的破裂［15］。导致细胞膜破坏的原因很多，包括金纳米棒爆炸、冲击波、气泡形成、热降解等［16］。Wang等［17］将与抗沙门氏菌抗体连接的金纳米与沙门氏菌结合后，接受近红外照射，发现能够导致细菌细胞的不可逆性的破坏，从而达到杀灭细菌的目的，推测与光热裂解有关系。上述文献已经证实光热治疗对细菌的有效性，真菌与细菌结构上存在一定的相似性，如都具备细胞壁结构及荚膜等。因此我们推测隐球菌细胞的死亡或者活性降低也与细胞膜破坏，光热裂解有关系，但还有待进一步的研究证实。近红外照射后可能能够导致局部温度的上升，由于金纳米棒爆炸、冲击波、气泡形成、热降解等作用杀伤或者杀死隐球菌细胞，这或许可以解释我们的实验中近红外照射后，不管是否与靶向性金纳米棒连接，隐球菌细胞的活性明显较对照下降。但是实验研究中我们发现隐球菌与靶向性金纳米棒连接后再接受照射其活性较直接接受照射也是明显下降的，因此，我们推测原因可能与以下几点相关:首先，金纳米棒上偶联的隐球菌特异性抗体使金纳米棒靶向性地聚集在隐球菌荚膜的周围，同时，金纳米棒将光能转化为热能，隐球菌周围热量得以升高，较对照组相比，对细胞的杀伤性更大。其次，我们推测由于抗原抗体反应发生后，是否会导致隐球菌荚膜结构或者细胞内部结构发生改变，而这些结构的变化使得隐球菌更容易被杀伤，或者对温度更加敏感。以上推测有待于进一步研究证明。

本次实验研究获得的结果，为光热方法治疗隐球菌感染提供了实验基础，在对抗真菌药耐药的情况下，我们可以尝试光热治疗。由于GNP-Ab对隐球菌的靶向性，光热效应更易局限于感染病灶，避免对周围正常组织的损伤，同时，也避免了系统使用抗真菌药物后出现的副作用。

综上所述，虽然目前的实验还处于体外阶段，但成功制备的GNP-Ab对隐球菌的特异性靶向性及光热效应，将为隐球菌病的治疗提供新的思路。

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