特康唑对常见念珠菌的体外敏感性试验

朱均昊 韩德忞 李莉 刘健惠 朱小婵 章强强

(1.复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室，上海200040;2.中国医药工业研究总院，上海200040)

外阴阴道念珠菌病 (vulvovaginal candidiasis，VVC)是一种常见的外阴阴道炎症性疾病，约75%的妇女一生中至少有1次VVC病史，40%～45%的妇女有2次或更多次VVC的发作，其中重度VVC是指临床症状严重，外阴或阴道皮肤黏膜有破损，按VVC评分标准，评分≥7分为重度［1］。为了解重度阴道念珠菌病病原学特征及其对常用抗真菌药物的耐药情况，我们对202例阴道念珠菌病患者的阴道分泌物进行真菌直接镜检、分离培养鉴定和抗真菌药物敏感性试验，旨在为临床诊断及合理用药提供依据。

1 材料和方法

1.1 临床资料

本研究共入选重度外阴阴道念珠菌患者202例。年龄 19～65 岁，平均 32.23±5.32 岁。

1.2 试剂

主要试剂 科玛嘉念珠菌显色培养基购自上海科玛嘉微生物技术有限公司，API 20C AUX购自法国生物梅里埃公司。RPMI-1640培养基 (粉末状)购自GIBCO公司，3-吗啉基丙磺酸 (MOPS)缓冲剂购自Sigma公司。

抗真菌药物 特康唑 (terconazole)为上海现代制药股份有限公司生产，批号:131113，含量:99.4%。克霉唑(clotrinazole)购自中国药品生物制品检定所，批号:100037-200306，咪康唑 (miconazole)购自中国药品生物制品检定所，批号:100213-200705，含量为99.7%。氟康唑 (fluconazole)辉瑞制药有限公司产品，批号UK-49858，含量99.8%。

1.3 方法

标本采集 采集阴道分泌物作真菌直接镜检，检出菌丝、假菌丝、大量出芽孢子，判为阳性，将阳性标本接种于沙氏培养基，37℃培养48 h。

分离培养与鉴定 将生长于沙氏培养基的菌落纯分离转种于科玛嘉念珠菌显色培养基上，37℃孵育24～48 h观察菌落的显色反应。同时，采用API 20C AUX鉴定系统鉴定至种。

药敏方法 参照美国国家临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的M27-A3(肉汤微量稀释法参考方案)进行药敏测定［2］。①药液制备:氟康唑以无菌蒸馏水溶解制成2 000μg/mL的储存液，特康唑、克霉唑、咪康唑以二甲基亚砜 (DMSO)溶解制成2 000μg/mL的储存液，保存于-20℃。②微量药敏反应板的制备:抗真菌药贮存液按M27-A3方案用RPMI 1640液体培养基做倍比稀释，加入96孔微量板，每孔100μL，特康唑、克霉唑、咪康唑在反应板上形成的药物浓度为0.024μg/mL～12.5 μg/mL，氟康唑在反应板上形成的药物浓度为0.25～128μg/mL。质控菌株与实验菌株同时检测。③最低抑菌浓度 (MIC)的判定:只有当生长对照菌株生长良好，且质控菌株的MIC值在CLSI/M27-A3方案制定范围内，才可进行结果的判定。菌株与待测药物在反应板上经35℃培养48 h。用肉眼观察法阅读结果:96孔培养板各孔充分混匀后，与生长对照孔比较，采用4分制评价各孔的浊度(均与各菌株的生长对照孔浊度比较)，吡咯类药物以2分为MIC。④微量肉汤稀释法MIC与临界浓度的解释:2008年CLSI/M27-A3提出了氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑对酵母菌的药敏临界浓度解释。酵母菌对特康唑，克霉唑，咪康唑无临界浓度判断，本实验仅分析其MIC。

质控菌株 质控菌株均由复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室提供，克柔念珠菌ATCC6258:氟康唑48 h读取的MIC质控范围16～128μg/mL，近平滑念珠菌ATCC 22019:氟康唑48 h读取的MIC质控范围1～4μg/mL。

1.4 统计分析

使用SPSS 13软件进行分析，采取频数分析微量肉汤稀释法中3种抗真菌药物对各类真菌的MIC 范围、MIC50、MIC90，GM(Geometric Mean，即几何均数)。两样本间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 213株念珠菌的菌种分布

在分离的临床菌株中，213例中有192例为白念珠菌 (90.14%)，21例 (9.86%)为光滑念珠菌，其中2例患者为白念珠菌和光滑念珠菌混合感染。

2.2 药敏结果

白念珠菌共192株，对特康唑、克霉唑、咪康唑的药物敏感性测定详见表1。

光滑念珠菌共21株，对特康唑、克霉唑、咪康唑的药物敏感性测定详见表2。

三种抗真菌药物对213株念珠菌的MIC值经统计学t检验没有显著性差异 (P＞0.05)。

2 讨 论

从分离的菌群显示阴道念珠菌病的病原体仍以白念珠菌为主，占到了90.14%(192/213)，其次为光滑念珠菌21株占了9.86%(21/213)，显示光滑念珠菌感染率有上升趋势，与国内其他报道相比［3-5］，本研究分离得到的白念珠菌的比例略高，这可能与地区差异有关。

表1 192株白念珠菌的体外药敏试验的结果Tab.1 192 isolates of C.albicans in vitro antifungal sensitivity

表2 21株光滑念珠菌的体外药敏试验的结果Tab.2 21 isolates of C.glabrata in vitro antifungal sensitivity

抗真菌药物是治疗VVC的主要手段，而各类药品对念珠菌的效果不一，因此，了解不同种类念珠菌对临床常见药物的敏感性有利于指导临床选择治疗方案。特康唑为唑类药物，可作用于阴道上皮组织的真菌孢子与菌丝，干扰真菌细胞膜的正常运转功能，破坏其机构的完整性，增加细胞膜的通透性而导致菌体破坏。我们通过美国临床和实验室标准化协会 (CLSI)公布的M27-A3方案，对从重度念珠菌性阴道炎患者阴道分泌物中分离的念珠菌进行了唑类抗真菌药物的药敏实验，借此来观察本地区常见阴道念珠菌对临床常用抗真菌药的敏感性，由于CLSI并未公布特康唑、克霉唑与咪康唑的体外药物敏感性相关信息，我们只分析本次实验所得的MIC值。在分别针对白念珠菌和光滑念珠菌的MIC值中，特康唑对光滑念珠菌的MIC90值要小于克霉唑，显示其对光滑念珠菌有较好的敏感性。特康唑、克霉唑、咪康唑三者对白念珠菌，光滑念珠菌的MIC50值皆小于0.5μg/mL，可见特康唑与其他唑类药物一样在针对重度念珠菌性阴道炎上依然有很好的敏感性。

综上所述，本研究通过检测特康唑体外对外阴阴道念珠菌病病原菌的敏感状况，证实其对常见阴道念珠菌具有良好的抑制作用，与克霉唑和咪康唑无统计学意义的差异，也没有发现有对特康唑耐药的菌株。

［1］ 中华妇产科学分会感染性疾病协作组.外阴阴道念珠菌病诊治规范(草案)［J］.中华妇产科杂志，2004(6):72-73.

［2］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of Yeasts;Approved standard-Third Edition.CLSI Document M27-A3［S］.2008.

［3］ 张贤华，浦文彧，万雄萍，等.外阴阴道念珠菌感染与耐药性的研究［J］.检验医学，2009，24(5):347-349.

［4］ 黄峰，秦淑国，边其侠.念珠菌性外阴阴道炎的病原菌分类和药敏分析［J］.中华全科医学，2010，8(1):101，118.

［5］ 宋海英，周惠娜，史剑雷，等.外阴阴道念珠菌感染及其耐药性［J］.江苏医药，2012，38(1):58-60.