黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜的抑制作用研究

颜贵明 施高翔 邵菁 汪天明 夏丹 汪长中

(1.安徽中医药大学中西医结合临床学院，合肥230038;2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，合肥230038)

近年来，因广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛应用、器官移植及导管技术的大量开展、HIV感染者与艾滋病患者的不断增加，机会致病性真菌引起的系统性感染已成为上述患者的主要死亡原因之一［1］。在院内获得性感染中，念珠菌引起的感染在血源性感染中居第四位，在导管相关性感染中居第三位，即便使用了抗真菌药物，其死亡率仍高达40%。在所有念珠菌感染中，以白念珠菌感染率最高，约占 45%［2］。

在目前临床常用抗真菌药物中，氟康唑因具有高效、广谱等优点而被广泛使用，但因长期使用其耐药性日益凸显［3］。白念珠菌产生耐药性的机制复杂，如多药耐药蛋白表达增加、唑类药物的作用靶点变异等均可导致真菌治疗的失败［4］;另一重要原因是白念珠菌容易形成生物膜，生物膜形成后，对环境的适应能力增强，对各种抗真菌药物敏感性下降。在当前高效低毒抗真菌药物匮乏的情况下，除了筛选或研发新药外，通过传统抗真菌药物与其他药物(包括天然小分子化合物)联合以达到协同增效、缩短疗程、减少毒副作用、扩大抗菌谱、延缓耐药性的出现，是目前抗真菌感染的一个重要策略。

黄芩苷 (baicalin，BA)是从双子叶植物唇形科Labiatae黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根提取而得的黄酮类化合物，药理作用广泛，不但具有抗炎、解热、保肝和调节免疫等作用［5］，且对白念珠菌也有一定的抗菌作用［6-8］。本研究拟从生物膜角度，探讨黄芩苷协同氟康唑对白念珠菌生物膜的抑制作用，为该药开发用于治疗由白念珠菌生物膜所致的慢性难治性真菌感染提供科学的实验依据，也进一步丰富中药有效成分抗真菌生物膜的科学理论。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌 (Candida albicans，C.albicans)SC5314由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠;6株临床分离株由安徽中医药大学第一附属医院皮肤科刘小平主任惠赠。

药物 氟康唑 (Fluconazole，FLC，批号100314-201204)购于中国食品药品检定研究院;黄芩苷 (纯度＞98%，批号XC20140301)，购于西安小草植物科技有限公司。

试剂 PBS 缓冲液 (pH7.0±2.0，实验室自配);25%戊二醛溶液 (国药集团化学试剂有限公司);DMSO(博美生物科技有限公司);XTT(加拿大BBI公司);维生素K3(美国Alexis公司);Total RNA提取试剂 (日本TOYOBO公司);PCR试剂(日本TOYOBO公司)。RPMI-1640培养基 (Life technologies公司)。

仪器 96孔细胞培养板 (Nunclon丹麦公司);恒温培养箱 (上海博迅实业公司);培养箱(上海一恒科技有限公司);SpectraMax M2e多功能酶标仪(美谷分子仪器有限公司);CX21型光学显微镜(OLYMPUS);激光共聚焦显微镜 (Leica TCS SP5，德国);扫描电子显微镜 (JSM-6700F，日本);7700型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 方法

菌悬液的配制 从4℃保存的YPD固体平板上挑取白念珠菌标准株SC5314和6株临床株的单菌落，接种至YPD培养液，37℃活化过夜，使其处于指数生长期，以RPMI 1640培养基调整菌液浓度至2×103CFU/mL和2×106CFU/mL备用。

取100μL白念珠菌悬液 (2×106CFU/mL)接种于96孔板中，37℃培养24 h，使白念珠菌完全黏附于96孔板底部，构建体外白念珠菌生物膜。倒置显微镜下初步鉴定白念珠菌生物膜的形成，并收集生物膜细胞备用。

棋盘法检测黄芩苷与氟康唑对白念珠菌作用

采用棋盘法［9］，将黄芩苷和氟康唑进行二倍的倍比稀释，黄芩苷和氟康唑的终浓度范围分别是1～2 000μg/mL与0.125～2 048μg/mL。药物相互作用包括协同作用、拮抗作用和无关作用，采用部分抑制浓度指数 (Fractional inhibitory concentration index，FICI)评价黄芩苷与抗真菌药物之间的相互作用。两药联合应用 FICI计算公式如下:FICI=MIC(BAincombination)/MIC(BAalone)+ MIC(FLCincombination)/MIC(FLCalone)，当 FICI≤0.5 时，两药的相互作用为协同作用 (synergy);0.5＜FICI≤4时为无关作用 (indifference);当 FICI＞4时为拮抗作用 (antagonism)。

时间-杀菌曲线实验［10］将白念珠菌SC5314活化至指数生长期，调整浓度至1×105CFU/mL，加入不同浓度的黄芩苷和氟康唑，设空白对照组。37℃分别培养 2、4、6、8、12、24 h 后，所有菌液中各取100μL液体，再以无菌PBS倍比稀释，从不同稀释倍数的菌液中各取100μL均匀涂抹于YPD固体培养基表面，于37℃恒温培养箱中培养48 h后计数菌落数目，以平皿上生长菌落数达20个为最低限。与起始菌液浓度相比，联合用药组菌落数变化≥2 log10CFU/mL时两药相互作用确定为协同作用，变化＜2 log10CFU/mL时，两药的相互作用则为无关。

XTT 减低法［11］和干重法［12］检测黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜形成的影响 将处于对数生长期的 C.albicans SC5314菌悬液 (2×106CFU/mL)与不同浓度的黄芩苷和氟康唑加入96孔板中，阳性药对照组(FLC 32μg/mL)，同时设空白对照组，37℃培养24 h，以无菌PBS缓冲液洗去未黏附细胞，加入XTT-menadione溶液，37℃继续避光孵育2 h，酶标仪在490 nm处测定A值。计算得SMIC50(即与空白对照孔比，抑制生物膜活性50%的药物浓度)。

将1.5 cm×1.5 cm的硅胶片 (75%酒精过夜浸泡)置于6孔板中，每孔加入2 mL小牛血清，37℃过夜培养。实验前以无菌PBS缓冲液将硅胶片清洗3次备用。在新的6孔板中加入2 mL菌液(2×106CFU/mL)，37℃黏附90 min后将硅胶片转移至新的6孔板中，加入含有不同浓度的黄芩苷和氟康唑的培养基，设空白对照组，37℃继续培养48 h。将硅胶片上的生物膜以无菌PBS缓冲液吹打下来，转移至已称重的1.5 mL EP管中，用无菌PBS缓冲液洗3次，置于烘箱过夜烘干，称重后减去EP管重量得生物膜重量。

扫描电子显微镜(SEM)和激光共聚焦显微镜(CLSM)观察白念珠菌生物膜形态结构［13-14］将1.5 cm×1.5 cm 的盖玻片 (75%酒精过夜处理)放入6孔培养板中，每孔加入2 mL RPMI 1640培养基(含小牛血清)，37℃过夜，取出玻片放入新的6孔板中，加入处于生长对数期的C.albicans SC5314菌细胞悬液 (2×106CFU/mL)和不同浓度的黄芩苷和氟康唑，设空白对照组，37℃培养24 h后，以无菌PBS缓冲液洗去未黏附菌，以2.5%戊二醛固定2 h，以30%、50%、70%和100%酒精梯度逐级脱水，每次20 min，自然干燥后，经HVS-GB型真空蒸镀仪喷金后，用扫描电镜观察拍照。

同时将处于对数生长期的菌悬液 (2×106CFU/mL)和不同浓度的黄芩苷和氟康唑加入激光共聚焦培养皿中，设空白对照组，37℃共培养24 h后，以无菌 PBS缓冲液洗去未黏附菌后，加入FUN1染料，避光染色1 h后，以激光共聚焦显微镜观察白念珠菌生物膜，另用Image J(1.48V)软件构建荧光三维结构图。

水-烃法检测细胞表面疏水性(cell surface hydrophobicity，CSH) 采用水-烃两相法测定C.albicans SC5314细胞表面疏水性［15］。将白念珠菌SC5314生物膜细胞 (2×106CFU/mL)和不同浓度的黄芩苷与氟康唑加入6孔板中，37℃共培养24 h后，3 000 r/min离心5 min收集菌体，以YPD培养液制备成菌悬液 (A600nm=1.0)，各取1.2 mL菌悬液置于新试管中，加入0.3 mL正辛烷。涡旋3 min，待两相分离后测定水相的A600nm值。以不加正辛烷的YPD培养液的A600nm值作为空白对照。CSH的计算方法:相对疏水性=(对照组 A600nm-实验组A600nm)/对照组 A600nm。

实时荧光定量PCR［16］总RNA的提取及逆转录 基因表达实验用于检测黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜和CSH相关基因的影响。黄芩苷与氟康唑联合作用C.albicans SC5314生物膜细胞后，离心收集菌体后进行总RNA提取。具体方法遵试剂盒说明书。

引物的设计与合成 根据NCBI基因库查得所需基因序列，并用Oligo 7.0软件设计引物，委托上海生工合成引物，各引物情况见表1。

表1 白念珠菌生物膜相关基因引物序列表Tab.1 PCR primers used for gene responsible of Candida albicans

实时荧光定量PCR反应 按SYBR Green试剂盒配制反应体系如下:2×SYBR Green Master Mix 12.5 μL，上游引物 (10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL，共25μL。95℃预变性1 min后，条件为:变性(95℃/15 s)→退火 (55℃/15 s)→延伸 (72℃/45 s)，共40循环。采用qRT-PCR仪进行扩增反应。实验重复3次。

定量分析 以ACT1作为内参基因，分别测定每个样品目的基因的Ct值。结果应用软件Graphpad Prism 5.0进行分析，基因表达水平用倍数变化(Fold change)来表示 (2-ΔΔCt法)。

1.3 统计学处理

所有的实验数据都是3次相同条件下独立实验的结果，以(珋x±s)表示。多组数据平均值的差异用单因素方差分析检验，P＜0.05被认为有显著性差异。

2 结 果

2.1 黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌的作用

实验以棋盘法分别检测黄芩苷与氟康唑合用前后对C.albicans SC5314和临床分离株的MIC和SMIC50值 (见表2)，并计算其对应的FIC指数。结果显示，黄芩苷与氟康唑对浮游菌和生物膜表现出良好的协同效果，可大大降低两药单用时的MIC和SMIC50，尤其对生物膜协同效果更显著，FICI均小于 0.5。

表2 棋盘法检测黄芩苷与氟康唑联合对C.albicans MIC及SMIC50Tab.2 Interaction of FLC and baicalin against C.albicans in MIC and SMIC50 of checkerboard microdilution assay(μg/mL)

2.2 黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌时间-杀菌曲线

实验结果如图1所示，黄芩苷 (62.5μg/mL)和氟康唑 (0.125μg/mL)单用组，与空白组差别不大;当不同黄芩苷与氟康唑联用时，当62.5μg/mL黄芩苷与0.125μg/mL氟康唑联用，表现出较强的抑菌作用，当125μg/mL黄芩苷与0.25μg/mL氟康唑联用时，则表现出杀菌作用。

2.3 黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜代谢与生物量的影响

实验结果表明，黄芩苷对白念珠菌SC5314生物膜形成的抑制作用随浓度增大而增强。当黄芩苷浓度为62.5μg/mL时对生物膜的形成几乎没有抑制作用，随着黄芩苷浓度的升高，其对生物膜的抑制作用也随之增强，当黄芩苷浓度为2 000μg/mL时，可抑制50%的生物膜形成 (P＜0.05)。同时当黄芩苷浓度为31.25μg/mL与FLC(32μg/mL)联用对生物膜的形成无明显抑制，当250μg/mL黄芩苷与32μg/mL FLC联用时抑制约50%生物膜形成 (P＜0.05)(见图 2a，2b)。

另外我们还通过干重法发现空白组形成很厚的生物膜使得硅胶膜不再透明，黄芩苷干预后的生物膜厚度薄于空白组，且有一部分已从硅胶膜上脱落下来(见图2c，2d)，黄芩苷与氟康唑联用组干重只相当于空白组45%(P＜0.05)，硅胶膜上仅见非常稀薄的生物膜，表明两药协同可严重影响生物膜的形成。

2.4 黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜形态结构的影响

本实验通过SEM进一步验证黄芩苷单用及联合氟康唑对白念珠菌SC5314生物膜的抑制作用。结果如图3所示，空白组形成成熟的生物膜，呈致密的三维立体结构，主要由菌丝相细胞包裹酵母相细胞，构成密集的多层次三维网状结构;而黄芩苷和氟康唑单用组相比于空白组，菌丝的形成明显减少，抑制了黏附细胞从酵母相转变为菌丝相，使生物膜不完整或者仅生成少量的由酵母相细胞组成的生物膜;而当黄芩苷与氟康唑联合干预后，视野未见完整生物膜的三维结构，只见有少量的酵母相黏附在玻片表面。

另外，我们还通过CLSM更直观地考察黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜形成的抑制作用。实验结果显示，经黄芩苷和氟康唑单用干预后形成的生物膜仅见有单层结构，当黄芩苷与氟康唑联用时，只见酵母相细胞，极少数细胞为菌丝相且菌丝较短，而空白组形成的生物膜有致密的三维结构，其中多为细长的菌丝(见图3)。

同时，我们采用Image J软件，三维重建技术将CLSM图像构建成荧光强度图，由图可见，空白组的荧光强度最强，提示生物膜结构完整，细胞状态佳，活性较好，且形成较厚的生物膜，菌体生长旺盛，而加药干预组的荧光强度则相对较弱，尤以黄芩苷和氟康唑的联合组荧光强度最弱，散见较强的荧光信号，表明其已无完整生物膜形成(见图3)。

2.5 黄芩苷联合氟康唑可降低白念珠菌生物膜CSH

将不同浓度黄芩苷处理的生物膜细胞刮取下来测得CSH值，结果如图4所示，空白对照组的CSH 值为 0.79，当黄芩苷 (62.5 μg/mL)和氟康唑 (0.125 μg/mL)单用时，CSH 值分别为 0.642和 0.601，当两药联用时，CSH 值减小至 0.271(P＜0.05)。

2.6 黄芩苷联合氟康唑影响白念珠菌生物膜相关基因的表达

为了揭示黄芩苷联合氟康唑抑制C.albicans SC5314的分子机制，我们采用qRT-PCR技术检测了生物膜相关基因ALS1、ALS3、EAP1和SUN41，表面疏水性调控基因CSH1。结果如图5所示，黄芩苷联合氟康唑使黏附相关基因ALS1、ALS3、EAP1、SUN41和CSH1的表达分别下调6%、51%、24%、13%和39%。

3 讨 论

白念珠菌耐药性的发生是临床上真菌感染治疗失败的重要原因之一。氟康唑作为目前使用最广泛的抗真菌药物，其耐药菌株的大量检出对抗真菌药物研究提出了新的挑战，减缓菌株耐药性的产生已成为抗真菌药物研究的新主题。白念珠菌可黏附于组织表面，由自身分泌胞外基质包裹菌细胞群体形成生物膜，生物膜可保护其膜内菌免受药物的杀伤和免疫系统的攻击［17］。目前很少采用单种药物来治疗生物膜感染，基于此，本研究着重探讨了黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜的抑制作用。

通过棋盘式微量液基稀释法考察黄芩苷和氟康唑联用抗白念珠菌的MIC。结果发现，黄芩苷单用有较强的抗白念珠菌活性，与氟康唑合用后则表现出显著的协同抗白念珠菌作用，合用之后两者的单用MIC和SMIC50均有较大程度的下降，其中对浮游菌的 FICI，除1 株为 0.75 外，其他均小于 0.5，对生物膜的FICI介于0.16～0.5之间，均表现出良好的协同作用。

时间-杀菌曲线实验发现，黄芩苷 (62.5μg/mL)和氟康唑 (0.125μg/mL)单用无抑制白念珠菌作用，而当两药联合时，4 h时即显示出强大的杀菌作用，此后可平稳抑制白念珠菌的生长。实验提示黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌的作用在白念珠菌的生长早期表现得更显著。

本实验以XTT减低法考察了白念珠菌生物膜代谢活性，结果显示黄芩苷单用及联合对白念珠菌生物膜的形成均具有较强的抑制作用，联用效果尤为明显。通过干重法来评价生物膜的生物总量(Biomass)，结果发现两药联用能大大降低其生物膜总量，提示两药的协同对白念珠菌的生物膜的形成具有较强的抑制作用。

SEM和CLSM观察验证了黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜的抑制作用，结果发现，黄芩苷和氟康唑单用组只能使生物膜不完整，菌丝相形成减少，而两药联用则可大大减少菌丝的形成，只见有酵母相细胞，破坏生物膜的完整结构。

图1 黄芩苷单用及联合氟康唑在不同时间对C.albicans SC5314的抑制作用 图2 黄芩苷单用及联合氟康唑对白念珠菌SC5314的生物膜代谢及干重的影响 (与空白对照组相比*P＜0.05，＊＊P＜0.01)。A.不同浓度黄芩苷单用对白念珠菌SC5314的生物膜形成的影响;B.不同浓度黄芩苷(31.25、62.5、125和250μg/mL)联合氟康唑 (32μg/mL)对白念珠菌SC5314的生物膜形成的影响;C.生物膜总量的统计图(BA:黄芩苷250μg/mL;FLC:氟康唑32μg/mL;BA+FLC:黄芩苷250μg/mL+氟康唑32μg/mL);D.黏附有生物膜的硅胶片的实物图 图3 SEM和CLSM观察黄芩苷和氟康唑单用及联合对C.albicans SC5314生物膜形态结构的影响 (BA:黄芩苷250μg/mL;FLC:氟康唑32μg/mL;BA+FLC:黄芩苷250μg/mL+氟康唑32μg/mL) 图4 黄芩苷单用及联合氟康唑对C.albicans SC5314生物膜细胞表面疏水性的影响(BA:黄芩苷 62.5 μg/mL;FLC:氟康唑 0.125 μg/mL;BA+FLC:黄芩苷62.5 μg/mL+氟康唑0.125 μg/mL，与空白对照组相比*P＜0.05，＊＊P＜0.01) 图5 黄芩苷联合氟康唑对C.albicans SC5314相关基因的表达的影响Fig.1 The time-kill curve of C.albicans SC5314 with the treatment of baicalin alone and in combination with fluconzole Fig.2 The effect of baicalin and in combination with fluconazole to the formation and the biomass of C.albicans SC5314 biofilms(Compared with control，*P＜0.05，＊＊P＜0.01).A.Different concentration ofbaicalin to the formation of C.albicans SC5314 biofilms;B.The effect of the formation of C.albicans SC5314 biofilms with the treatment of baicalin(31.25，62.5，125 and 250 μg/mL)combination with 32 μg/mL fluconazole;C.The statistical chart of biofilm biomass of C.albicans SC5314 biofilms(BA:baicalin 250μg/mL;FLC:fluconazole 32μg/mL;BA+FLC:baicalin 250μg/mL+fluconazole 32μg/mL);D.The real object of silica gel pieces with biofilms in 24 well microtiter plate Fig.3 The effect of baicalin alone and in combination with fluconazole to the morphology of C.albicans SC5314 biofilms(BA:baicalin 250 μg/mL;FLC:fluconazole 32 μg/mL;BA+FLC:baicalin 250 μg/mL+fluconazole 32 μg/mL)Fig.4 The effect of baicalin alone and in combination with fluconazole to CSH of C.albicans SC5314 biofilms(BA:baicalin 62.5 μg/mL;FLC:fluconazole 0.125 μg/mL;BA+FLC:baicalin 62.5 μg/mL+fluconazole 0.125 μg/mL，Compared with control，*P＜0.05，＊＊P＜0.01)Fig.5 The effect of baicalin in combination with fluconazole on the expression of C.albicans SC5314 related genes

研究表明，白念珠菌形成生物膜的过程包括黏附期、微菌落形成期和生物膜成熟期［18］，黏附是至关重要的第一步。白念珠菌的黏附主要由其细胞表面的黏附素，如 Als1p、Eap1p、Sun41p等与宿主细胞表面相应受体结合并通过一定的信号转导而产生，因此本实验以qRT-PCR检测黄芩苷联合氟康唑检测上述基因的转录水平。ALS和EAP1基因编码白念珠菌细胞壁表面糖蛋白，参与白念珠菌的黏附过程，促进菌丝形成［19-20］。SUN41参与细胞壁和生物膜的形成以及菌丝对宿主细胞的黏附等［21］。qRT-PCR实验结果表明，两药联用能显著的下调上述基因的表达，继而通过特定信号转导作用影响其蛋白表达水平。

CSH是白念珠菌重要的毒力因子之一，在白念珠菌黏附和生物膜形成中起重要作用［22］。本实验中测定经不同浓度黄芩苷处理的白念珠菌生物膜的CSH，结果表明，黄芩苷和氟康唑单用可一定程度降低CSH值，两药联用则可显著降低CSH值，CSH1基因表达水平也降低，提示CSH1表达水平下降而导致的细胞表面疏水性降低是黄芩苷联合氟康唑抑制白念珠菌生物膜形成的分子机制之一。

由于黄芩苷能一定程度的抑制白念珠菌，因此本实验在此基础上进一步探讨了黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜的抑制作用及机制。结果表明，黄芩苷联合氟康唑可通过下调白念珠菌生物膜相关基因的转录水平，降低细胞表面疏水性从而减弱白念珠菌的毒力，发挥协同抗白念珠菌生物膜作用。

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