上海地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化分析

李鑫，葛菲菲，刘健，鞠厚斌，杨德全，周锦萍，刘佩红

上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103

·论著·

上海地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化分析

李鑫，葛菲菲，刘健，鞠厚斌，杨德全，周锦萍，刘佩红

上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103

为阐明上海地区H9N2亚型禽流感病毒分离株的遗传变异、分子特征和重组模式，选取2002和2006～2014年分离自活禽市场、家禽养殖场和生猪屠宰场的14株H9N2亚型禽流感病毒进行分析。这14株病毒分别来源于鸡、鸭、鸽、野鸡咽喉和泄殖腔样品及猪肺脏样品，用H9亚型荧光反转录-聚合酶链反应(RTPCR)试剂盒检测后，阳性样品经无特定病原体(SPF)级鸡胚尿囊腔接种并分离病毒，用血凝抑制(HI)实验进一步确定其血凝素(HA)亚型。RT-PCR分别扩增这14株病毒全基因并进行序列测定，分析8个基因片段的遗传发生关系，发现这些分离株主要由F/98亚系、Y280亚系、G1亚系及未知亚系重组而成。根据8个基因片段的组合情况，这14株病毒可分成5个基因型。2002、2006～2008年分离的5株H9N2亚型禽流感病毒代表了4个不同基因型，2009～2014年分离的9株H9N2亚型禽流感病毒属第5种基因型，推测可能与疫苗免疫选择压力有关。因此，在以后工作中加强H9N2亚型禽流感分子流行病学监测是非常必要的。

H9N2亚型禽流感;序列测定;系统发育分析

Key words:H9N2 subtype avian influenza;Sequence determination;Phylogenetic analysis

禽流感是禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一种禽类传染病。目前，根据表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)基因和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)基因，禽流感病毒可分为16种HA亚型和9种NA亚型。我国大多数H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因均属BJ/94亚系(A/ chicken/Beijing/1/1994)和 G1 亚 系 (A/quail/ Hongkong/G1/1997)，而内部基因则表现出明显的多样性［1，2］。H9N2亚型禽流感病毒能引起禽类产蛋下降和免疫抑制病，或与其他病原体混合感染导致高死亡率，给我国养殖业造成了巨大的经济损失［3-5］。H9N2亚型禽流感病毒有多种宿主，目前已在鸡、鸭、鹌鹑、野鸡、鹧鸪和鸽等禽类中检测到，是禽类中广泛流行的流感病毒亚型［6，7］。其也能传染给猪(猪被称为流感病毒的“混合器”)，从而产生了具有新的抗原和基因特点的变异株［8，9］。然而，对于猪源H9N2亚型禽流感病毒是否能传染给禽类，目前尚不清楚。近年来流行的H9N2亚型禽流感病毒具有与哺乳动物唾液酸α2，6受体结合的特性，并出现了人感染事件［10，11］。值得注意的是，血清学调查显示我国人群中的H9N2抗体阳性率达13.7%～37.2%［12，13］。因此，该亚型禽流感病毒是否存在潜在的流行性引起人们广泛关注。

本研究对2002、2006～2014年分离自上海地区活禽市场、家禽养殖场的13株和河南生猪屠宰场的1株H9N2亚型禽流感病毒株的全基因进行测序，从分子生物学角度了解各毒株间的变异规律，并与我国江浙地区及其他部分地区2002～2013年的H9N2亚型禽流感病毒株、目前上海地区使用的2种疫苗株A/chicken/Shandong/6/1996和A/chicken/ Shanghai/F/1998各基因片段进行比较，进而从基因水平了解上海地区该亚型禽流感病毒的流行规律，并对疫苗的免疫效果进行初步评价。

1 材料与方法

1.1 病毒和鸡胚

A/chicken/Shanghai/Y1/2002、 A/chicken/ Shanghai/Y1/2006、A/chicken/Shanghai/Y1/2007、A/duck/Shanghai/C60/2007、A/chicken/Shanghai/ Y2/2008、A/duck/Shanghai/C163/2009、A/swine/ Henan/Y1/2009、A/chicken/Shanghai/A/2010、A/ chicken/Shanghai/C/2011、A/chicken/Shanghai/C1/ 2012、 A/chicken/Shanghai/C2/2012、 A/pigeon/ Shanghai/JC1/2013、 A/chicken/Shanghai/1107/ 2013和 A/wild chicken/Shanghai/C1/2014由本实验室于2002、2006～2014年从上海地区的活禽市场、家禽养殖场和河南生猪屠宰场分离并鉴定，无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。H9荧光反转 录-聚 合 酶 链 反 应 (reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒由凯杰生物工程(深圳)有限公司提供，新城疫阳性血清、禽流感血凝素分型血清(H5、H9)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，一步法RT-PCR试剂盒购自宝生物(大连)工程公司，特异引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，AxyPrep体液病毒 DNA/ RNA小量试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒的初步鉴定鸡咽喉和泄殖腔样品经荧光RT-PCR试剂盒检测，选取阳性样品，处理后接种9～11日龄鸡胚尿囊腔，将收集的尿囊液用β微量法进行血凝实验，检测其血凝性及血凝效价。根据所测得的效价，将尿囊液配制成4单位的溶液，分别用新城疫阳性血清及H5、H9亚型禽流感病毒阳性血清进行血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)实验，以检测该分离病毒的血凝性能否被H9亚型禽流感病毒阳性血清所抑制，详细步骤参照GB/ T 18936-2003高致病性禽流感诊断技术［14］。

1.2.2 引物的设计及合成根据GenBank上已发表的序列，针对8个基因片段分别设计相关引物(参照文献进行［14］)。

1.2.3 病毒RNA的提取和RT-PCR提取病毒基因组RNA，具体步骤按说明书进行。采用TaKaRa One Step RT-PCR Kit行 RT-PCR扩增。体系为: PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μl，2×1 Step Buffer 25 μl，上、下游引物各1 μl，RNA 10 μl，加水至50 μl(参照文献进行［14］)。

1.2.4 基因片段的cDNA克隆、鉴定和测序RTPCR产物电泳后经凝胶回收，按pMD 18-T载体说明书进行连接、转化，用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定;鉴定为阳性克隆后，送上海桑尼生物科技有限公司测序(参照文献进行［14］)。

1.2.5 基因cDNA核苷酸序列分析14株H9N2亚型禽流感病毒的名称、基因序列号、采样地点及分离宿主的健康状态详见表1。除了A/swine/Henan/ Y1/2009外，其余13株均来源于上海本地养殖场。采用DNAStar 4.0的MegAlign软件进行分析，获得序列的同源性及一些关键位点的变化情况(参照文献进行［14］)。

表1 14株H9N2亚型禽流感病毒株Tab.1 H9N2 subtype avian influenza virus isolates used in this study

1.2.6 绘制系统发育树借助MEGA软件，分析14个毒株8个基因片段的遗传演化情况(参照文献进行［14］)。

2 结果

2.1 病毒的初步鉴定结果

14株病毒的鸡胚尿囊液血凝性能被H9亚型阳性血清抑制，而不能被H5亚型阳性血清和新城疫阳性血清所抑制。对NA基因测序，结果均为N2。表明这14株病毒均为H9N2亚型禽流感病毒。

2.2 cDNA全序列关键位点的分析及同源性比较

14株H9N2亚型禽流感病毒的一些关键位点详细分析见表2。本研究中14株毒株HA基因裂解位点序列为PARSSRGLF或PSRSSRGLF，对禽类为低致病力(包括3株从发病鸡群中分离的H9N2亚型禽流感病毒毒株)。2002年和2006年分离株HA基因的226位氨基酸为Gln(Q)，2007～2014年的分离株其226位氨基酸为Leu(L)，具有与哺乳动物唾液酸α2，6受体结合的特性［9］。所有毒株HA基因的228位氨基酸均为Gly(G)。这14株病毒在NA基因颈部均存在9个核苷酸缺失(63～65位氨基酸)。Liu等［15］报道，在我国分离到的 12株H9N2亚型禽流感病毒的NA基因颈部均存在9个核苷酸缺失，被认为是我国H9N2亚型禽流感病毒的一个分子标签。本研究中14株病毒的M2蛋白31位Ser(S)均被Asn(N)取代，表明对金刚烷胺有耐药性［16］。所有毒株的PB2蛋白627位氨基酸和701位氨基酸均为Glu(E)和Asp(D)，表明这些毒株均为禽源。这14株 H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列的同源性分别为89.1%～99.3%、88.8%～98.8%、91.0%～99.6%、90.6%～99.1%、93.3%～99.8%、86.3%～ 99.9%、85.0%～ 99.2% 和86.8%～99.6%。

表2 分离株一些关键位点的分析Tab.2 Comparison of several key sites of H9N2 subtype avian influenza virus isolates

2.3 绘制系统发育树

借助MEGA软件，建立H9N2亚型禽流感病毒的系统发育树(图1)。

2.4 14株病毒8个基因片段的遗传演化分析

图1 14株H9N2亚型禽流感病毒HA(115～999 nt)、NA(59～1 235 nt)、M(270～765 nt)、NP(2～1 445 nt)、NS(34～693 nt)、PA(23～1 257 nt)、PB1(182～1 080 nt)和PB2(32～2 228 nt)的基因进化树Fig.1 Phylogenetic trees of HA(115-999 nt)，NA(59-1 235 nt)，M(270-765 nt)，NP(2-1 445 nt)，NS(34-693 nt)，PA (23-1 257 nt)，PB1(182-1 080 nt)and PB2(32-2 228 nt)genes of 14 isolates of H9N2 subtype avian influenza virus

根据绘制的系统发育树，对8个基因片段的遗传关系进行分析(表3)。14株病毒株中，13株HA基因属Y280亚系，仅A/chicken/Shanghai/Y1/2002属F/98亚系。用MEGA软件计算得知，这14株病毒与2株疫苗株的遗传距离分别为0.05～0.118(与A/chicken/Shandong/6/1996相比)和0.054～0.119 (与A/chicken/Shanghai/F/1998相比)。根据遗传关系分析，A/chicken/Shanghai/Y1/2002和 A/ chicken/Shanghai/Y1/2006为二重重组体，由F/98亚系和Y280亚系重组而成，前者NS基因来源于Y280亚系，后者HA和M基因来源于Y280亚系。2007～2014年分离到的毒株重组方式均比较复杂，为四重或四重以上重组体，主要由F/98亚系、Y280亚系、G1亚系及未知亚系重组而成，尤其是 A/duck/Shanghai/C60/2007，其 NA和PA基因均属未知亚系。这14株病毒经过重组产生了5个不同基因型，2002年、2006～2008年分离的5株H9N2亚型禽流感病毒株分别代表4个不同基因型，2009～2014年分离的9株H9N2亚型禽流感病毒属第5个基因型。此外，从基因片段的组成方式来看，2009～2014年分离的毒株与以前相比，来源于F/98亚系的基因片段减少了，推测可能与上海地区使用F/98疫苗后产生的免疫选择压力有关。

表3 H9N2亚型禽流感病毒的基因分型Tab.3 The genotypes of H9N2 subtype avian influenza viruses

3 讨论

H9N2亚型禽流感病毒在世界很多地区都有报道，包括北美、南美、欧洲、非洲、亚洲和太平洋地区。流感病毒的特点意味着其易于抗原漂移(antigenic drift)和抗原漂变(antigenic shift)，从而导致宿主范围不断扩大［4］。在早期研究中，H9N2亚型禽流感病毒仅能从火鸡和鸭中分离到;近年来，从鸡、鸟类、猪和人类中也分离到了该病毒。这些病毒还能成为其他亚型禽流感病毒的基因片段供体，2013年感染人的 H7N9禽流感病毒多个内部基因就来源于H9N2亚型禽流感病毒［17］。因此，继续进行H9N2亚型禽流感病毒的监测有重要的公共卫生意义。

HA蛋白是禽流感病毒毒力的主要决定因素，HA裂解为HA1和HA2是禽流感病毒感染细胞的先决条件。本研究中，14株H9N2亚型禽流感病毒的 HA基因裂解位点序列为 PARSSRGLF或PSRSSRGLF，均为低致病性毒株裂解位点的特征序列;但2007～2014年分离到的毒株其第2位氨基酸残基由非极性氨基酸(A)突变为极性氨基酸(S)，这是否会影响病毒的生物学特性，还需进一步研究。通过计算14株病毒的HA1亚单位遗传距离，发现除A/chicken/Shanghai/Y1/2002外，其余13株病毒与2株疫苗株之间的遗传距离均＞7%，显示目前上海地区使用的2株疫苗与近年来流行的毒株已有明显差异，可能需更换新的疫苗。通常认为，当流感病毒HA1亚单位遗传距离＞7.0%时，就需更新相应的疫苗株［18］。

本研究主要选择了我国江浙地区及其他部分地区2002～2013年的H9N2亚型禽流感病毒株，与上海分离到的毒株进行比对分析，发现在相近年份从不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒之间没有明显的基因变异。目前分析显示，其变异程度与时间更相关。本研究中的14株H9N2亚型禽流感病毒分别来源于鸡、鸭、鸽、野鸡和猪5种宿主，通过序列比对及进化树分析发现，从不同宿主中分离到的H9N2亚型禽流感病毒之间的差异并不明显，提示禽流感病毒或许能在不同宿主中交互传播［6，19-21］。这14株病毒均为重组体。值得注意的是，从2007年开始，分离到的毒株重组模式均比较复杂，尤其是A/duck/Shanghai/C60/2007，其HA和PB1基因来源于Y280亚系，M和PB2基因来源于G1亚系，NP和NS基因来源于F/98亚系，NA和PA基因来源则未知。有文献报道［6］，对2000～2001年从中国南方家鸭中分离到的H9N2亚型禽流感病毒进行抗原性和基因分析，发现20世纪90年代在鸡和鹌鹑中建立的H9N2亚型禽流感病毒基因型已返回到家鸭中，与鸭中已存在的流感病毒杂交产生二重体或三重体。

本研究中有3株H9N2亚型禽流感病毒 A/ chicken/Shanghai/C1/2012、 A/chicken/Shanghai/ C2/2012和A/chicken/Shanghai/1107/2013分离自发病鸡群，其余毒株均分离自健康动物群体。分析表明，这3株毒株与相近年份分离的毒株没有明显基因变异，致病机制尚不清楚，有待进一步研究。但能从健康动物群体中分离到H9N2亚型禽流感病毒，提示H9亚型与其他亚型流感病毒之间有着很高的发生基因重配的风险。综上所述，加强H9N2亚型禽流感病毒的监测并密切关注其重组趋势有重要意义。

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第三期不明原因发热诊治进展学习班

(会议预告)

由首都医科大学附属北京友谊医院感染内科主办的“第三期不明原因发热诊治进展学习班”将于2015年6月6日(星期六)在北京友谊医院召开。我们诚挚邀请您前来参加此次学习班。

不明原因发热的诊治是临床难题之一，给患者带来极大的痛苦;诊治过程涉及临床各科，是对医务人员和医疗机构诊治疑难疾病能力的巨大挑战。本次学习班将围绕不明原因发热诊治的最新进展和疑难病例报告及文献复习，从现代医学和中医学两个角度对不明原因发热诊治的相关问题进行详细的阐述和讲解，促进各位同道的交流，促进中西医结合。我们将努力把此次学习班打造成一个良好的学习交流平台。

初步议题

1.不明原因发热的诊断思路;2.不明原因发热中西医结合诊治;3.自身炎症性疾病的诊治;4.危重感染的抗生素应用及耐药菌治疗策略;5.不明原因发热的中医诊治;6.病例报告之一:难治性发热一例报告;7.病例报告之二:不明原因发热一例。

学分授予

北京市级继续教育学分Ⅱ类2分

参会报名联系

蔡老师

电话:010-5710 8106;移动电话:188 1024 2122;E-mail:fuoxxb@163.com

Phylogenetic analysis of H9N2 subtype avian influenza virus isolated in Shanghai

LIXin，GE Fei-Fei， LIU Jian， JU Hou-Bin，YANG De-Quan，ZHOU Jin-Ping，LIU Pei-Hong
Shanghai Animal Disease Control Center，Shanghai 201103，China

In order to explore the genetic variation and molecular characteristics of H9N2 subtype avian influenza viruses in Shanghai，fourteen H9N2 subtype avian influenza viruses were isolated from live poultry markets，poultry farms and pig slaughterhouses in 2002 and 2006-2014.These specimens included paired tracheal and cloacal swabs from chickens，ducks，pigeons and domestic wild chickens and lung samples from pigs.They were determined as H9 subtype by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)and then isolated by using 10-day-old specific pathogen free chicken eggs，further identified as H9 subtype by hemagglutination inhibition(HI)test.The eight gene segments of the fourteen virus strains were amplified by RT-PCR and sequenced.Phylogenetic analysis revealed that the isolates were reassortants mainly of A/chicken/Shanghai/F/ 1998，A/duck/HongKong/Y280/1997，A/quail/HongKong/G1/1997.Five virus strains isolated from 2002 and 2006-2008 represented four different genotypes.The other nine virus strains isolated in 2008-2014 was different from the above four genotypes.This may be related to the pressure of immune selection by vaccine.

.LIU Pei-Hong，E-mail:cathrinevet@163.com

2014-09-05)

上海市市级农口系统青年人才成长计划〔沪农青字(2014)第2-8号〕

刘佩红