多重聚合酶链反应与荚膜肿胀试验对肺炎链球菌血清分型的比较研究

彭拓华，李柏生，曾洪辉，柯碧霞，杨彤，柯昌文

1.广东省生物制品与药物研究所，广州 510440;2.广东省疾病预防控制中心，广州 511433

多重聚合酶链反应与荚膜肿胀试验对肺炎链球菌血清分型的比较研究

彭拓华1，李柏生2，曾洪辉1，柯碧霞2，杨彤1，柯昌文2

1.广东省生物制品与药物研究所，广州 510440;2.广东省疾病预防控制中心，广州 511433

为评估多重聚合酶链反应(PCR)对肺炎链球菌血清分型的可行性，分别采用多重PCR和荚膜肿胀试验对568株肺炎链球菌进行血清分型，并对分型结果进行比较分析。结果显示，568株肺炎链球菌中，213株通过荚膜肿胀试验分出16个血清群，主要有血清群19(23.1%，131/568)、6(5.3%，30/568)、23(1.6%，9/ 568)、14(1.4%，8/568)、9(1.1%，6/568)、15(1.1%，6/568)等，分型率为37.5%(213/568);356株通过多重PCR分出21个血清群，主要有血清群19(27.8%，158/568)、23(8.5%，48/568)、6(7.4%，42/568)、14 (4.4%，25/568)、3(4.2%，24/568)、15(3.5%，20/568)等，分型率为62.7%(356/568)。荚膜肿胀试验鉴定出血清群4和18，但多重PCR未能鉴定;多重PCR鉴定出血清群5、12、35、16、17和22，但荚膜肿胀试验未能鉴定。多重PCR与荚膜肿胀试验对19F、19A血清型的鉴定无显著差异。结果提示，这2种方法对肺炎链球菌血清分型结果有差别，多重PCR的分型率高于荚膜肿胀试验。对来源复杂的标本进行肺炎链球菌血清分型，2种方法可相互补充，以提高分型率。

肺炎链球菌;血清分型;多重聚合酶链反应;荚膜肿胀试验

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是引起儿童和成人社区获得性肺炎的重要致病菌，易引起气管炎、乳突炎、肺炎，甚至严重的侵袭性肺炎链球菌疾病，如脑膜炎、胸膜炎、脓毒症、菌血症等［1，2］。我国每年因肺炎链球菌相关性疾病导致死亡的儿童数位列全球前10［3］。荚膜多糖是肺炎链球菌的关键致病因素，也是疫苗作用的靶点。根据荚膜多糖的不同，已鉴定出46个血清群，93个血清型。传统经典的血清分型方法是荚膜肿胀试验［4］，但其有抗血清昂贵、不能自动化、不能批量检测及有一定的主观性等局限。随着90多种血清型荚膜多糖基因序列(cps)的公布，分子分型技术因能简单、快捷地检测肺炎链球菌血清型而有望得到广泛应用［5］。本研究对同一标本，分别用多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和荚膜肿胀试验进行血清分型，检测其中几种常见、重要的肺炎链球菌血清群/型(15、6、9V、14、18、19F、23F、19A)，并评价多重PCR用于肺炎链球菌血清分型的可行性，旨在寻找一种适合我国流行病学调查和研究的肺炎链球菌血清分型方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

倒置生物显微镜购自德国Leica公司，PCR扩增仪购自德国Biometra公司，凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司，全自动核酸提取仪购自德国Qiagen公司，乳胶凝集法肺炎链球菌试剂盒购自法国梅里埃公司，血清分型试剂盒Pneumotest购自丹麦SSI公司，细菌DNA提取试剂盒为QIAampⓇDNA Mini and Blood Mini Kit，Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒购自日本TaKaRa公司，琼脂糖购自法国Biowest公司，TA载体试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 实验菌株

1.2.1 菌株来源639株肺炎链球菌由广东省12家医院提供，分离时间为2005～2013年，标本来源包括血、痰、脑脊液等。

1.2.2 质控菌株选取标准菌株ATCC 49619(已知血清型为19F)作为质控菌株。

1.3 荚膜肿胀试验

严格按产品说明书操作。油镜下如果荚膜显著肿大，菌体周围有一无色而较宽的环状物时，判断为荚膜肿胀试验阳性。

1.4 多重PCR

用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，多重PCR扩增相关基因。82对血清型特异性引物序列参考相关文献［6］，由宝生物工程(大连)有限公司合成。基因检测在温度梯度PCR仪上进行，设立空白对照(试剂)和阳性对照。PCR反应体系为Premix Taq 12.5 μl，模板DNA 1.5 μl，引物10 μl，双蒸水补至25 μl。扩增条件:94℃预变性4 min;94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃2 min，30个循环;72℃ 2 min。PCR产物电泳后观察结果。

2 结果

2.1 乳胶凝集试验

639株肺炎链球菌中，61株复苏后未能成活，10株乳胶凝集阴性，568株乳胶凝集阳性。结果见表1。

2.2 荚膜肿胀试验与多重PCR血清分型结果的比较

568株肺炎链球菌中，213株被荚膜肿胀试验分出血清型，分型率为37.5%;356株被多重PCR分出血清型，分型率为62.7%。结果见表2。

568株肺炎链球菌中，213株肺炎链球菌被荚膜肿胀试验分出16个血清群，主要集中在血清群19 (23.1%，131/568)、6(5.3%，30/568)、23(1.6%，9/568)、14(1.4%，8/568)、9(1.1%，6/568)、15 (1.1%，6/568)等，有2个血清群用多重PCR未能分出;356株肺炎链球菌被多重PCR分出21个血清群，主要集中在血清群19(27.8%，158/568)、23 (8.5%，48/568)、6(7.4%，42/568)、14(4.4%，25/ 568)、3(4.2%，24/568)、15(3.5%，20/568)等，有7个血清型用荚膜肿胀试验未能分出。结果见表3。

表1 568株肺炎链球菌的标本类型Tab.1 The specimensources of 568 Streptococcus pneumoniae strains

表2 荚膜肿胀试验与多重PCR血清分型率的比较Tab.2 The serotyping rate of multiplex PCR and capsular swelling test

表3 荚膜肿胀试验与多重PCR血清分型的比较Tab.3 The serotyping results of multiplex PCR and capsular swelling test

将213株被荚膜肿胀试验分出血清型的肺炎链球菌打乱编号，用多重PCR重新分型，发现被2种方法分为相同血清型的有145株，占68.1%;不相同血清型的有27株，占12.7%;未能分出血清型的有41株，占19.2%。结果见表4。

对131株被荚膜肿胀试验分出血清型19F、19A、19、19B的肺炎链球菌，用多重PCR重新分型，发现被2种方法分为相同血清型的有19F(64.9%，85/131)、19A(12.2%，16/131)，未能鉴别血清型的占15.3%(20/131)，分为其他血清型的有6、1、3、15、12、23、14，合计10株，占7.6%。经卡方检验，对肺炎链球菌血清型19F和19A，荚膜肿胀试验与多重PCR分型结果无显著性差异。结果见表5。

表4 213株荚膜肿胀试验可分型肺炎链球菌用多重PCR鉴别的结果Tab.4 Multiplex PCR serotyping results of 213 strains which could be indentified by capsular swelling test

表5 荚膜肿胀试验血清分型为19的131株肺炎链球菌用多重PCR鉴别的结果Tab.5 Multiplex PCR serotyping results of 131 serotype 19 strains identified by capsular swelling test

3 讨论

本研究结果显示，荚膜肿胀试验血清分型率明显低于多重PCR，前者分型率只有37.5%，后者达62.7%。主要原因是荚膜肿胀试验是根据荚膜多糖的不同来鉴定血清型，而本研究收集的肺炎链球菌菌株来自12家医院，时间跨度长，最早的分离于2005年，且菌株来源广泛，分离自脑脊液、血液、脓液和咽拭子等，有些菌株可能经多次传代，在传代过程中已丢失了荚膜，以致荚膜肿胀试验阴性;多重PCR主要是通过提取细菌DNA，进行PCR扩增，通过电泳图谱来判断菌株的血清分型，不受荚膜是否存在的影响，可对荚膜阴性菌株分型。另外，荚膜肿胀试验与多重PCR的血清分型吻合度有差异，主要是前者根据荚膜多糖的抗原性差异进行血清学分类;而后者是提取荚膜多糖相关基因，在特殊酶的催化下合成不同荚膜多糖基因序列，基因产物是蛋白，不是多糖，有可能基因表达产物出现差异。

本研究用两种方法相结合对肺炎链球菌进行血清分型，先进行荚膜肿胀试验，再进行多重PCR，结果发现可血清分型的菌株有389株，未能分型的有179株，肺炎链球菌总血清分型率只有68.5%(389/ 568)，低于文献报道［7，8］，特别是荚膜肿胀试验的血清分型率更低(37.5%，213/568)。可能原因:一是本研究样本类型繁多，有痰、血液、脑脊液、角膜脓液等分泌物及其他或不详的来源，尤其是来自痰样本的菌株有336株(占52.6%)，其他或不详来源的菌株有145株(占22.7%);二是样本主要来自粤东、粤西和珠江三角洲等12家二甲以上医院，大部分是地方医院，而医院分离、鉴别和保藏的水平参差不齐，有些菌株再鉴别发现不是肺炎链球菌，有些菌株在送检过程中死亡或用于完成荚膜肿胀试验后样本量不足以进行多重PCR，有些菌经过多次传代后荚膜已丢失。

肺炎链球菌能否致病与荚膜有密切关系。根据荚膜多糖的抗原特性，发现肺炎链球菌可分为46个血清群，90个血清型。在全球范围内，80%以上侵袭性肺炎仅与20余种血清型有关。肺炎链球菌血清型构成随地域、年龄和时间会不断变迁，因此需不断监测。监测显示，常见的血清群/型有19F、23F、19A、6B、14、6A等。美国1998～1999年19A型仅占侵袭性肺炎的2.5%，2005年达36%，仅次于19F，位居第2［9，10］。在北京，6A、23F、6B、19F等是常见血清型，7价疫苗覆盖率为33.9%［11］;在南京48株侵袭性肺炎链球菌血清分型中，以19F比例最高(27.1%)，其次是19A(22.8%)、14(18.7%)、9V(8.3%)、6B(6.3%)、23F(6.3%)，以19F和19A最常见［7］;在深圳，则以19F、23F、6B、4等常见，7价疫苗覆盖率为94.4%［12］。本研究收集鉴定的568株肺炎链球菌中，389株能成功分型，共分出23个血清群，以19最常见(31.9%，181/568)，依次为 6(8.8%，50/568)、23(7.4%，42/568)、14 (3.9%，22/568)、3(4.2%，24/568)、15(3.2%，18/ 568)，与国内外报道基本一致。肺炎链球菌疫苗是预防感染的有效手段，因此应密切关注人群中致病性血清型的变迁，为新型疫苗的研制和选择提供依据。

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·国外研究信息·

Pyroptosis引起的细胞死亡在人类免疫缺陷病毒1型感染中驱动CD4+T细胞耗竭

细胞凋亡是造成人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者CD4 T细胞耗竭的一个关键机制，但对其具体信号通路知之甚少。该研究表明，caspase-3介导的细胞凋亡在已活化的和有效感染的CD4+T细胞死亡中所占比重很小。余下超过95%的静息CD4+T细胞是由流产病毒感染引发的caspase-1介导的pyroptosis死亡。Pyroptosis是细胞程序性死亡的一种强烈炎症模式，即胞质内容物和促炎性细胞因子包括白细胞介素1β (IL-1β)的释放。这条死亡通路连接HIV感染的两个重要特征——CD4+T细胞耗竭和慢性炎症，使将死的CD4+T细胞释放炎症信号，以吸引更多的细胞死亡，导致恶性循环。此循环可被caspase-1抑制剂所阻断，且证明在人类中是安全的，这为靶向宿主而不是病毒本身的新型抗艾滋病治疗策略提供了理论依据。

(Doitsh G，et al.Nature，2014，505(7484):509-514.)

Serotyping of Streptococcus pneumoniae by multiplex polymerase chain reaction and capsular swelling test

PENG Tuo-Hua1，LI Bai-Sheng2，ZENG Hong-Hui1，KE Bi-Xia2，YANG Tong1，KE Cang-Wen2
1.Guangdong Provincial Institute of Biological Products and Materia Medica，Guangzhou 510440，China;2.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 511433，China

The main purpose of the research is to evaluate the application feasibility of multiplex polymerase chain reaction(PCR)in serotyping of Streptococcus pneumoniae.A total of 568 strains were subjected to multiplex PCR and capsular swelling test respectively.The results demonstrated that 37.5%of the strains(213/568)could be successfully serotyped by capsular swelling test into 16 different serotypes，including serotypes 19(23.1%，131/ 568)，6(5.3%，30/568)，23(1.6%，9/568)，14(1.4%，8/568)，9(1.1%，6/568)and 15(1.1%，6/ 568);while 62.7%of the strains(356/568)could be successfully serotyped by multiplex PCR into 21 different serotypes，including serotypes 19(27.8%，158/568)，23(8.5%，48/568)，6(7.4%，42/568)，14(4.4%，25/568)，3(4.2%，24/568)and 15(3.5%，20/568).The multiplex PCR could not identify serotypes 4 and 18 which could be identified by capsular swelling test，while the capsular swelling test could not identify serotypes 5，12，35，16，17 and 22 which could be successfully identified by multiplex PCR.There was no significant difference between the two methods to identify serotypes 19F and 19A.The results suggest that there is significant difference between the two methods in serotyping of Streptococcus pneumoniae.Multiplex PCR is more effective than the conventional capsular swelling test，especially for those specimens collected from complicated sources.The combination of the two methods can improve the serotyping efficiency of Streptococcus pneumoniae.

Streptococcus pneumoniae;Serotyping;Multiplex polymerase chain reaction;Capsular swelling test

.KE Cang-Wen，E-mail:kecw1965@aliyun.com

2014-08-08)

中美新发和再发传染病合作项目

柯昌文