噬菌体对黏质沙雷菌感染BALB/c小鼠的保护作用

徐花，李毅，逯茵茵，周佳琦，韩放，李诗恒，孙延波

1.吉林大学白求恩医学部基础医学院病原生物学系，长春 130021;2.吉林大学白求恩医学部口腔医学院，长春 130021

噬菌体对黏质沙雷菌感染BALB/c小鼠的保护作用

徐花1，李毅2，逯茵茵1，周佳琦1，韩放1，李诗恒1，孙延波1

1.吉林大学白求恩医学部基础医学院病原生物学系，长春 130021;2.吉林大学白求恩医学部口腔医学院，长春 130021

本文旨在观察噬菌体对黏质沙雷菌感染小鼠的治疗作用，为噬菌体疗法应用于细菌性感染提供依据。以黏质沙雷菌为宿主菌，采用双层琼脂噬斑法从污水中分离和纯化裂解性噬菌体。将最小致死量的黏质沙雷菌经腹腔感染BALB/c小鼠后，立即腹腔注射不同剂量的噬菌体，观察动物的生存率并确定噬菌体的保护剂量。在动物感染后的不同时间(0、20、40、60和180 min)观察噬菌体疗法对动物存活率的影响。将噬菌体和细菌同时或分别注射动物后，分析噬菌体在动物体内的药代动力学。结果显示，经噬斑法从污水中分离出1株裂解性噬菌体(命名为φSM9-3Y)，电镜观察发现该噬菌体属有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。动物腹腔感染黏质沙雷菌并立即给予噬菌体后发现，当噬菌体的保护剂量为108PFU/ml时，动物的存活率为100%。动物感染后40和60 min给予噬菌体(1010PFU/ml)治疗，动物的存活率为60%。药代动力学表明，将噬菌体和细菌同时注入动物体内，在6 h内噬菌体的滴度维持在1010PFU/ml。结果提示，噬菌体对黏质沙雷菌所致动物腹腔内感染的治疗是有效的，提示针对细菌性感染的噬菌体疗法具有潜在的应用价值。

黏质沙雷菌;噬菌体;噬菌体疗法

黏质沙雷菌为兼性厌氧、革兰染色阴性杆菌，是肠杆菌科重要成员之一。其广泛分布于自然界，亦可存在于医院环境中。作为条件致病菌，黏质沙雷菌可引起医院内感染［1，2］。例如，黏质沙雷菌引起的新生儿感染，特别是免疫功能低下、低出生体重新生儿的感染有较高的病死率。有研究显示［3］，在新生儿监护病房革兰阴性杆菌感染中，黏质沙雷菌感染占11.2%。此外，黏质沙雷菌对中枢神经系统有较高的亲和性［4］，通过血液(菌血症)可致脑膜炎和脑脓肿，治疗不及时可引起患者死亡。近年来，由于抗生素的过度和不合理使用，革兰阴性杆菌耐药和多重耐药菌株不断出现，这无疑给治疗和控制细菌性感染带来了极大的困难。2012年中国CHINET耐药监测显示［5］，黏质沙雷菌对哌拉西林、头孢唑林和头孢噻肟的耐药率分别为24.2%、96.3%和29.0%。因此，寻找和开发新型抗菌生物制剂刻不容缓。噬菌体是一类能特异感染细菌的病毒，存在于自然环境中。将噬菌体或其代谢产物应用于食品消毒、实验室诊断和细菌感染等，已受到科研人员和医疗机构的关注［6，7］。积极开展噬菌体生物学特性和抗感染噬菌体疗法的研究，具有重要现实意义和潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源10株黏质沙雷菌由吉林中医药大学附属医院检验科分离，采用法国梅里埃公司VITEK-32全自动微生物分析系统鉴定。

1.1.2 实验动物选用6～8周龄雌性BALB/c小鼠，体重(16±0.5)g，购自吉林大学白求恩医学院实验动物研究中心。

1.1.3 主要试剂使用营养琼脂(青岛高科园海博生物技术有限公司)、LB液体培养基(胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g，加dH2O至1 L)和SM缓冲液(NaCl 5.8 g、MgSO42 g、明胶100 mg、1 mol/L Tris 50 ml，H2O 950 ml)。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体的分离和电镜观察取污水1 000 ml，加CaCl2至终浓度1 mmol/L，加入新鲜培养黏质沙雷菌悬液和LB培养基50 ml，置30℃过夜培养。离心取上清液，用0.22 μm滤器过滤除菌。分别以10株黏质沙雷菌为宿主菌，与滤过液混合，静置15 min，加入融化的0.7%LB琼脂(50℃)，并均匀铺于固体营养琼脂平板上，37℃培养16 h。噬菌斑形成后，挑取单个噬菌斑接种至对应的宿主菌，进行扩增。细菌裂解液经10 000 g离心，取上清液连续10倍稀释，取100 μl加入100 μl相应宿主菌，测定噬菌体滴度(滴度=稀释倍数×噬菌斑数×10 PFU/ml)。将初步纯化的噬菌体颗粒放入SM缓冲液中，取20 μl滴于铜网上，自然沉淀15 min，用滤纸从侧面吸干多余液体，加2%磷钨酸至铜网，染色10 min，待铜网干燥后进行电镜观察。

1.2.2 黏质沙雷菌最小致死量的测定取对数生长期的黏质沙雷菌SM9-3(OD600值为0.5时，密度为2×108CFU/ml)，4℃ 6 000 g离心5 min。用灭菌生理盐水悬浮并将菌液系列稀释成下列密度: 106、107、108、109CFU/ml。将动物分成4组(每组5只)，第1组动物左下腹腹腔注射106CFU/ml菌液，第2组注射107CFU/ml菌液，第3组注射108CFU/ml菌液，第4组注射106CFU/ml菌液，注射体积为0.5 ml。同时设对照组(腹腔注射等量生理盐水)。观察7 d，导致小鼠全部死亡的最低剂量为最小致死量(minimal lethal dose，MLD)。

1.2.3 噬菌体疗法对黏质沙雷菌感染BALB/c小鼠的保护作用确定MLD后，将动物分成5组(每组5只)，每只左下腹腹腔注射MLD的黏质沙雷菌0.5 ml，随后每组动物分别于右下腹腔立即注射不同剂量的噬菌体悬液(0.5 ml)，对照组腹腔注射生理盐水。每24 h观察动物的死亡情况，连续观察15 d，计算并比较动物的生存率。

1.2.4 BALB/c小鼠感染后不同时间的噬菌体疗效观察动物左下腹腹腔注射MLD的黏质沙雷菌0.5 ml后，于不同时间(0、20、40、60和180 min)给予噬菌体治疗，即右下腹腹腔注射相同剂量噬菌体悬液(0.5 ml)，同时设对照组。每24 h观察动物死亡情况，连续观察15 d，计算并比较动物的生存率。

1.2.5 噬菌体在动物体内的药代动力学观察将动物分成3组(每组5只)，第1组腹腔注射黏质沙雷菌SM9-3，第2组腹腔注射噬菌体，第3组注射黏质沙雷菌和噬菌体。在注射后不同时间(2、4、6、24和48 h)取动物内眦静脉血，置肝素处理过的Eppendorf管内。采用噬斑法计算噬菌体滴度(PFU/ml)，平板稀释法计算细菌的菌落数(CFU/ ml)，观察噬菌体在血液内存留的时间和滴度，以及噬菌体和细菌同时注入动物体内后两者的变化。

1.3 数据统计分析

各组动物的生存率比较采用四格表资料的χ2检验。

2 结果

2.1 噬菌体φSM9-3Y的分离和电镜观察

以黏质沙雷菌为宿主菌，从环境污水中分离出1株裂解性的噬菌体命名为φSM9-3Y。电镜观察显示，噬菌体φSM9-3Y为有尾噬菌体(图1)，其头部呈20面体立体对称，直径约70 nm，其尾部呈管状，长约50 nm。噬菌体的管状尾部具有收缩功能，可将核酸注入宿主菌。尾部的末端由尾丝构成，是识别和吸附菌体表面分子的重要结构。根据形态特征和 Ackermann分类法［8］，黏质沙雷菌噬菌体φSM9-3Y属于有尾噬菌体目(Caudovirales)肌尾噬菌体科(Myoviridae)。

图1 噬菌体φSM9-3Y的电镜照片Fig.1 Electron micrograph of phage φSM9-3Y with a contracted tail

2.2 黏质沙雷菌MLD的测定

将不同剂量黏质沙雷菌悬液分别经腹腔感染4组动物后，每24 h观察动物死亡情况。结果显示，细菌密度为108CFU/ml和109CFU/ml时，72 h内动物全部死亡(图2)。即黏质沙雷菌MLD为108CFU/ml，并将其作为本研究中动物感染的MLD。

图2 黏质沙雷菌MLD的测定Fig.2 Detection of MLD of Serratia marcescens2.3 噬菌体疗法对黏质沙雷菌感染BALB/c小鼠的保护作用

将动物分成5组(每组5只)，每只动物左下腹腹腔注射MLD的黏质沙雷菌0.5 ml，随后每组动物分别于右下腹腔立即注射不同剂量的噬菌体悬液(0.5 ml):106、107、108、109和1010PFU/ml，对照组腹腔注射生理盐水。结果显示，噬菌体滴度为107PFU/ml时，动物生存率为80%;而108PFU/ml以上时，动物生存率为100%(图3)。即噬菌体应选择108PFU/ml以上作为黏质沙雷菌感染动物模型的治疗剂量。

图3 不同剂量噬菌体对黏质沙雷菌感染BALB/c小鼠的保护作用Fig.3 Dose effect of phage φSM9-3Y on rescuing BALB/c mice from lethal Serratia marcescens infection

2.4 BALB/c小鼠感染后的不同时间内噬菌体的保护作用

为进一步观察BALB/c小鼠感染后不同时间内噬菌体的疗效，在感染后0、20、40、60和180 min，右下腹腹腔注射相同剂量噬菌体悬液(1010PFU/ ml)0.5 ml，观察动物生存率。结果显示，在感染后0 min和20 min给予噬菌体治疗，动物生存率为100%;感染后40 min和60 min，动物生存率为60%;而感染后180 min，动物生存率为40%。统计分析表明，与对照组比较，动物感染后0和20 min经噬菌体疗法，其生存率有显著性差异(P＜0.01);感染后40和60 min，其生存率亦有显著性差异(P＜0.05)(图4)。

图4 黏质沙雷菌感染后的不同时间内噬菌体的保护作用Fig.4 Protective effects of phage φSM9-3Y at different time points after infection

2.5 噬菌体在动物体内的药代动力学

体内药代动力学显示，单独腹腔注射噬菌体(1010PFU/ml)后2 h，血液中噬菌体滴度已开始下降，但48 h后噬菌体滴度稳定在106PFU/ml。将噬菌体(1010PFU/ml)和细菌(108CFU/ml)同时腹腔注射后4 h和6 h，噬菌体滴度＞1010PFU/ml，细菌密度分别为3×102CFU/ml和104CFU/ml;48 h后噬菌体滴度＞106PFU/ml，细菌密度降至0.7×102CFU/ml。单独注射细菌后，细菌数量虽下降，但动物由于菌血症而死亡(图5)。

图5 噬菌体在动物体内的药代动力学Fig.5 Pharmacokinetics of phage φSM9-3Y

3 讨论

抗生素自发明以来，一直被认为是解决细菌性感染的最有效武器。但随之而来的抗生素滥用现象日益突出，直接和间接导致细菌耐药性加剧，多重耐药菌株特别是“超级细菌”频频出现［9］，致使抗生素疗法面临一系列困难。噬菌体是能感染细菌的病毒，广泛存在于自然界。裂解性噬菌体在菌体内增殖并最终裂解细菌，从而达到灭菌目的。噬菌体疗法证实［10］，利用这一独特性可治疗人和动物的细菌性感染。与传统抗生素相比，噬菌体在研发、生产、治疗和不良反应方面显现出独特的优势［11，12］。

本研究采用10株黏质沙雷菌为宿主菌，从环境污水中分离出1株裂解性(毒性)噬菌体，命名为φSM9-3Y，电镜观察该噬菌体属肌尾噬菌体科。将初步纯化后的噬菌体悬液(滴度保持在1012PFU/ ml)用于黏质沙雷菌的抗感染研究。在建立感染动物模型过程中，选用雌性BALB/c小鼠，通过腹腔感染黏质沙雷菌，进入血液，形成菌血症，最终致动物死亡。结果显示，黏质沙雷菌的 MLD为108CFU/ml。以MLD的黏质沙雷菌感染动物，随即给予噬菌体进行保护发现，噬菌体滴度在108PFU/ml以上时，动物的生存率为100%。在动物感染后的不同时间内，选择噬菌体治疗的滴度为1010PFU/ ml，在感染后即刻和20 min后给予噬菌体治疗，动物的生存率均为100%;而感染后40 min和60 min给予噬菌体治疗，动物的生存率下降至60%，但仍有统计学意义(P＜0.05)。一方面表明进入体内的噬菌体可裂解细菌，具备抗感染作用，另一方面亦提示噬菌体治疗在早期应用效果明显。初步的药代动力学进一步表明，将噬菌体和黏质沙雷菌同时注入动物体内，4 h后噬菌体的滴度由最初的1010PFU/ ml增加至1011PFU/ml，即增加10倍。这是因为噬菌体在细菌体内增殖后释放的结果。一般认为，1个噬菌体进入细菌后，通过增殖和裂解菌细胞，可释放出100个子代噬菌体［13］，这也从另一角度反映出噬菌体在裂解细菌过程中的显著效能。本研究结果表明，噬菌体对黏质沙雷菌所致BALB/c小鼠感染是有效的，为进一步开展噬菌体疗法的研究提供了依据。

虽然噬菌体的应用有一定的局限性，如裂解谱较窄以及应用前要确认何种细菌感染，但对于耐药性细菌的感染，噬菌体疗法则具有独特性。噬菌体用于治疗皮肤和黏膜表面的感染已得到大多数学者的认同［14］。2009年，英国医学和保健品协调署授权皇家耳鼻喉专科医院从事一项噬菌体治疗慢性耳炎的Ⅰ期和Ⅱ期临床研究［15］，结果令人满意。相信在不久的将来，噬菌体疗法及其产品的应用将受到广泛的认可和重视。

［1］ Bollmann R，Halle E，Sokolowska-Köhler W，Grauel EL，Buchholz P，Klare I，Tschape H，Witte W.Nosocomial infectionsdue to Serratia marcescens. Clinicalfindings，antibiotic susceptibility patterns and fine typing［J］.Infection，1989，17(5):294-300.

［2］ Vigeant P，Loo VG，Bertrand C，Dixon C，Hollis R，Pfaller MA，McLean AP，Briedis DJ，Perl TM，Robson HG.An outbreak of Serratia marcescens infections related to contaminated chlorhexidine ［J］. Infect Control Hosp Epidemiol，1998，19(10):791-794.

［3］ Larson EL，Cimiotti JP，Haas J，Nesin M，Allen A，Della-Latta P，Saiman L.Gram-negative bacilli associated with catheter-associated and non-catheter-associated bloodstream infections and hand carriage by healthcare workers in neonatal intensive care units［J］.Pediatr Crit Care Med，2005，6(4): 457-461.

［4］ Messerchmidt A，Prayer D，Olischar M，Pollak A，Birnbacher R.Brain abscesses after Serratia marcescens infection on a neonatal infection care unit:differences on serial imaging［J］.Neuroradiology，2004，46(2):148-152.

［5］ 汪复，朱德姝，胡付品，蒋晓飞，胡志东，李全，孙自镛，陈中举，徐英春，张小江，王传清，王爱敏，倪语星，孙景勇，褚云卓，俞云松，林洁，徐元宏，沈继录，苏丹虹，卓超，魏莲花，吴玲，张朝霞，季萍，张泓，孔菁，胡云建，艾效曼，单斌，杜艳.2012年中国CHINET细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2013，13(5):321-330.

［6］ Housby JN，Mann NH.Phage therapy［J］.Drug Discov Today，2009，14(11-12):536-540.

［7］ Maura D，Debarbieux L.Bacteriophages as twenty-first century antibacterial tools for food and medicine［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，90(3):851-859.

［8］ Ackermann HW.Tailed bacteriophages:the order caudovirales［J］.Adv Virus Res，1998，51(4):135-201.

［9］ Kumarasamy KK，Toleman MA，Walsh TR，Bagaria J，Butt F，Balakrishnan R，Chaudhary U，Doumith M，Giske CG，Irfan S，Krishnan P，Kumar AV，Maharjan S，Mushtaq S，Noorie T，Paterson DL，Pearson A，Perry C，Pike R，Rao B，Ray U，Sarma JB，Sharma M，Sheridan E，Thirunarayan MA，Turton J，Upadhyay S，Warner M，Welfare W，Livermore DM，Woodford N.Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India，Pakistan，and the UK:a molecular，biological，and epidemiological study［J］.Lancet Infect Dis，2010，10(9):597-602.

［10］ Abedon ST，KuhlSJ，BlasdelBG，KutterEM.Phage treatment of human infections［J］.Bacteriophage，2011，1 (2):66-85.

［11］ Hanlon GW.Bacteriophages:an appraisal of their role in the treatment of bacterial infections［J］.Int J Antimicrob Agents，2007，30(2):118-128.

［12］ Parracho HM，Burrowes BH，Enright MC，McConville ML，HarperDR.Theroleofregulated clinicaltrailsin the development of bacteriophage therapeutics［J］.J Mol Genet Med，2012，6:279-286.

［13］ Lu TK，Koeris MS.The next generation of bacteriophage therapy［J］.Curr Opin Microbiol，2011，14(5):524-531.

［14］ Chan BK，Abedon ST，Loc-Carrilo C.Phage cocktails and the future of phage therapy［J］.Future Microbiol，2013，8(6): 769-783.

［15］ Wright A，Hawkins CH，AnggårdEE，HarperDR.A controlled clinical trail of a therapeutic bacteriophage preparation in chronic otitis due to antibiotic-resistantPseudomonas aeruginosa;a preliminary reportofefficacy ［J］. Clin Otolaryngol，2009，34(4):349-357.

Experimental phage therapy against Serratia marcescens infection in BALB/c mice

XU Hua1， LIYi2， LU Yin-Yin1， ZHOU Jia-Qi1，HANG Fang1， LIShi-Heng1，SUN Yan-Bo1
1.Department of Pathogen Biology，College of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China;2.Hospital of Stomatology，Jilin University，Changchun 130021，China

This study aims to evaluate the efficacy of phage therapy against Serratia marcescens infections in mice and to provide the basis of phage therapy applied in bacterial infections.Double-agar overlay plaque method was employed to screen lytic phages from sewage，using Serratia marcescens isolates as hosts.Serratia marcescens strains at minimal lethal dose(MLD)were injected intraperitoneally(i.p.)into BALB/c mice and an i.p.of phage was followed.The survival rate of animals and protective dose of phage were examined at different time points(0，20，40，60 and 180 min)after the bacterial challenge.Pharmacokinetics of phages injected alone or with bacteria was analyzed respectively.The results showed that a lytic phage，designated φSM9-3Y，was isolated and characterized from sewage.Electron microscope revealed that phage φSM9-3Y was in Siphoviridae family，Caudovirales order.After injection of Serratia marcescens isolates，immediate phage therapy at dose of 108PFU/ ml reached a protection rate of 100%.The protection rate was around 60%with a phage therapy(1010PFU/ml) delivered 60 min after the infection.Pharmacokinetics analysis showed that phage titer in blood was maintained at level of 1010PFU/ml within 6 h when phages were injected i.p.together with bacteria.These data indicate thatphages can save animals from pathogenic Serratia marcescens infection and suggest that phage therapy may be potentially used for the control of bacterial infections.

Serratia marcescens;Phage;Phage therapy

.SUN Yan-Bo，E-mail:sunyb@jlu.edu.cn

2014-03-04)

吉林省产业技术研究与开发项目(2013C015-2)

孙延波