响应曲面优化蛤蟆油中核苷类成分尿嘧啶提取条件

石婷婷曹 岗岳显可

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响应曲面优化蛤蟆油中核苷类成分尿嘧啶提取条件

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蛤蟆油；响应曲面法；尿嘧啶；提取工艺

哈蟆油（oviductus ranae）为蛙科动物中国林蛙（rana temporaria chensinensis，David）雌蛙输卵管经采制干燥而得，始载于《神农本草经》，并被列为上品。《本草纲目》中称之“山哈”，别名哈士蟆油、哈蟆、雪蛤，富有滋补“软黄金”的美誉[1－2]。蛤蟆油成分复杂，含有多种氨基酸、不饱和脂肪酸、激素类和磷酯类成分。

据报道，尿嘧啶等生物碱类成分具有干扰病毒DNA、RNA的复制从而抑制病毒增殖，起到保护细胞免受病毒损害的作用[3－4]，对二磷腺苷（ADP）诱导的家兔血小板聚集也有显著的抑制作用[5－6]。影响蛤蟆油核苷类成分提取率的因素很多，如提取溶剂、提取温度、提取时间、料液比等，常规提取工艺不能全面展示各因素间的相互影响，实际操作过程中造成蛤蟆油大量损失。本研究在单因素试验的基础上，采用响应曲面法对蛤蟆油中核苷类成分尿嘧啶的提取溶剂、提取时间、液料比三因素的三个水平进行中心组合试验研究，分析得出尿嘧啶最佳提取工艺参数，为蛤蟆油中尿嘧啶及其他核苷类成分的提取提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪 器 Ultimate3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司）；梅特勒XS－105电子分析天平（0.01 mg，METTLER TOLEDO，Switzerland）；KS－80中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；R－201恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）。

1.2 试 药 蛤蟆油购自浙江中医药大学中药饮片有限公司。尿嘧啶（批号100469－201302）购自中国药品生物制品鉴定所。

1.3 标准溶液的制备 精密称取尿嘧啶标准品（批号100469－201302，含量：99.6%）7.10 mg，用甲醇定容至50mL。移取上述试液10.0mL。重新定容至20.0mL，即标准溶液。

1.4 色谱条件 岛津Inertsil ODS－SP Extend C18（250mm×4.6mm，5.0μm）柱，二极管阵列检测器（DAD），以甲醇（A）－水溶液（B）为流动相梯度洗脱，0～10min，1%～5%A；10～15min，5%～15%A；15～20min，15%～20%A；20～30min，20%A；30～35min，20%～35%A；35～40min，35%～1%A；流速1mL/min，柱温30℃，检测波长230nm；进样量为10μL。

2 结果

2.1 蛤蟆油中尿嘧啶提供工艺单因素试验

2.1.1 甲醇浓度对尿嘧啶提取量的影响 以加热时间60min，加热温度60℃，料液比1∶40为条件，分别以甲醇体积分数为0、20%、40%、60%、80%、100%进行提取，考察甲醇体积分数对蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影响。结果显示纯水作为溶剂，尿嘧啶提取量最高，故选择纯水作为蛤蟆油提取溶剂。见图1。

图1 甲醇体积分数对蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影响

2.1.2 加热温度对蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影响以水为提取溶剂，加热时间60min，料液比1∶40为条件，分别以40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃进行提取，尿嘧啶提取量为 18.10、17.76、17.39、17.95、17.09、16.83μg/g。所以温度对尿嘧啶提取没有明显差异，下面试验40℃为提取温度。

2.1.3 加热时间对蛤蟆油尿嘧啶提取量的影响 以水为提取溶剂，加热温度40℃，料液比1∶40为条件，分别加热15、30、60、90、120、150min进行提取，考察加热取时间对蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影响。结果表明，加热60min，蛤蟆油尿嘧啶提取量最高，见图2。

图2 加热时间对蛤蟆油尿嘧啶提取量的影响

2.1.4 料液比对蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影响 以水为提取溶剂，加热温度40℃，分别以料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80加热提取60min，考察液料比对蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影响。结果显示，料比为1:70时尿嘧啶提取量最高，见图3。

图3 加热时间对蛤蟆油尿嘧啶提取量的影响

2.2 响应面优化试验设计 根据中心组合设计原理，结合响应面分析方法，以甲醇体积分数、料液比和热浸时间三个因素为自变量，以尿嘧啶得率为响应值，设计三因素三水平共17个试验点的响应面分析试验。其中，14个为析因试验，3个为中心试验。甲醇体积分数、热浸时间、料液比编码：X1=（x1－20）/ 20，X2=（1/x2－60）/30，X3=（x3－60）/10。

2.3 响应曲面法试验方案及结果分析 在单因素条件的基础上。采用响应曲面法优选蛤蟆油尿嘧啶的提取工艺。通过拟合二次方程.计算最优工艺组合以及尿嘧啶最大理论提取量。利用Design－Expert 8.0.5b软件进行响应曲面分析。以尿嘧啶的提取量为指标，考察40℃条件下甲醇体积分数、加热时间以及料液比对尿嘧啶提取量的影响。响应曲面因素与水平见表1。实验方案设计与响应值结果见表2。

表1 响应曲面因素与水平表

由表3可知，由模型拟合得到的回归方程P＜0.0001。可判定响应值与全体自变量变化关系为显著相关。模型对应同归方程Y=15.85－26.74X1－0.16X2＋1.51X3＋0.38X1X2－1.05X1X3－0.070X2X3＋22.21X12＋0.15X22＋0.69X32。

表2 响应曲面设计方案以及相应值

表3 响应曲面方差分析表

各项对响应值影响作用次序为提取溶剂＞料液比＞提取时间。交互项X1X3与其它响应值相比，对响应值影响最大。提取溶剂和料液比相互作用示意图见图4。使用Design－Expert8.0.5b软件得到最优提取工艺为：在甲醇体积分数为0（即为纯水提取），加热时间30min，料液比1:69.99（g/mL）条件下，蛤蟆油尿嘧啶获得量预测值为68.7925μg/g。验证实测值为68.73μg/g，接近预测值，误差为0.39%。说明该工艺稳定、可行。

图4 甲醇体积分数和料液比对尿嘧啶得率影响的响应曲面图

3 讨论

哈蟆油在我国的药用历史悠久，具有补肾益精、健脾益胃、滋阴补肾、润肺生津等功效。现代药理研究表明，其对体弱气虚、精力耗损、记忆力不佳、神经衰弱等疗效较好[4]。

本实验采用响应面法考察提取溶剂、加热时间和料液比对蛤蟆油尿嘧啶提取工艺进行优化研究，得到最佳提取条件为：以水为提取溶剂，液料比1∶69.99（g/mL），加热时间30min，蛤蟆油尿嘧啶得率最高。

［1］姜大成，肖井雷.中国林蛙与蛤蟆油［M］.长春：吉林科学技术出版社，2006：10-12.

［2］梁磊，张绪慧，周毅，等.哈蟆油胶囊对衰老模型小鼠生殖器官的保护作用［J］.南方医科大学学报，2008，28（6）：982-985.

［3］姚晖，王晓娟，黄莉萍，等.哈蟆油对D-半乳糖所致雄性衰老大鼠肝组织CyclinD1、CDK6和P15蛋白表达的影响［J］.南方医科大学学报，2010，30（5）：1044-1046.

［4］顾红缨，林卓，徐云，等.蛤蟆油调节小鼠细胞免疫功能的实验研究［J］.吉林中医药，2010，30（12）：1103-1104.

［5］王涵，赵雨，张梅，等.哈蟆油非水溶性成分抗疲劳保健功能研究［J］.安徽农业科学，2011，39（20）：12233-12234，12271

［6］童湘伟，易延逵，邓虹珠，等.UV法测定哈蟆油中蛋白质的含量［J］.湖南中医杂志，2011，27（4）：128-129.

（收稿：2014-07-29 修回：2014-09-22）

1杭州市第三人民医院中药房（杭州 310009）；2浙江中医药大学中药炮制技术研究中心（杭州 310053）

石婷婷，Tel：15868486269；E－mail：shitingting@163.com