缺血后处理对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的影响

陈碧瑶 李 斌 韦思明 王 力

缺血后处理对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的影响

陈碧瑶 李 斌 韦思明 王 力

目的 观察缺血后处理对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的影响。方法 60只成年雄性SD大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组和缺血后处理组，每组20只。对照组行左侧睾丸假手术。缺血再灌注组予左侧睾丸扭转720度，2h后复位。缺血后处理组予左侧睾丸扭转720度，2h后行缺血后处理，即先将睾丸复位，血流再灌注10s，然后将睾丸再次扭转720度，使睾丸缺血10s，反复6个循环，最后睾丸复位，血流持续灌注。复位后4h，每组处死大鼠10只，行左侧睾丸切除术，测定睾丸组织丙二醛水平。复位后3个月，各组处死剩余的大鼠，行左侧睾丸切除术，分析睾丸生精功能。结果睾丸组织丙二醛含量缺血后灌注组＞缺血后处理组＞处理组［（2.73±0.34）、（1.86±0.29）、（1.45± 0.20）mmol/mg］（P＜0.05），睾丸生精功能对照组＞缺血后处理组＞缺血后灌注组［（22.03±1.97）、（15.13±1.81）、（2.14±0.42）×106］（P＜0.05）。结论 缺血后处理对睾丸缺血再灌注损伤有保护作用，其作用机制可能与降低活性氧水平有关。

大鼠；睾丸缺血再灌注损伤；缺血后处理；睾丸扭转复位

睾丸扭转又称精索扭转，是指精索沿其纵轴旋转，精索内血管受压阻塞，导致睾丸缺血甚至梗死。25岁以下男性发病率为1/4000，因此该病并非少见[1]。复位是治疗睾丸扭转的主要方法，可以恢复睾丸血液供应，避免发生梗死。但是睾丸复位后往往出现萎缩，生精功能障碍[2]。睾丸扭转复位后的损伤是一个典型的缺血再灌注损伤。本研究建立大鼠睾丸缺血再灌注损伤模型，探讨缺血后处理对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的影响，为临床治疗提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动 物 成年雄性SD大鼠（250～300g）60只（上海实验动物中心），动物生产许可证号SCXK（沪）2012－0002。

1.2 试 剂 丙二醛试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，聚乙二醇辛基苯基醚、氯化钠﹑伊红和叠氮钠购自Sigma公司。

2 实验方法

2.1 大鼠睾丸缺血再灌注损伤模型建立及其处理采用随机数余数分组法将60只成年雄性SD大鼠分为对照组、缺血再灌注组和缺血后处理组，每组20只。将氯胺酮（50mg/kg）注入大鼠腹腔内麻醉。所有手术在无菌条件下施行。在大鼠左侧髂腹股沟做一切口，施行以下手术。对照组：通过此切口取出左侧睾丸，用11/0无创伤缝线穿过睾丸白膜。然后通过原切口放睾丸入阴囊内，缝合切口。缺血再灌注组：通过同样的切口取出左侧睾丸，将睾丸绕精索逆时针旋转720度，在睾丸白膜与阴囊之间用11/0无创伤缝线缝合固定，保持睾丸缺血状态。2h后，拆除缝线，将睾丸反方向旋转720度复位，睾丸恢复血液供应，依旧存活，放睾丸入阴囊内，缝合切口。缺血后处理组：通过同样的手术方式造成睾丸缺血，2h后行缺血后处理，即先将睾丸复位，血流再灌注10s，然后将睾丸再次旋转720度，使睾丸缺血10s，反复6个循环。最后睾丸复位，血流持续灌注。复位后4h，每组处死大鼠10只，行左侧睾丸切除术，测量丙二醛水平。复位后3个月，处死剩余大鼠，行左侧睾丸切除术，分析睾丸生精功能。

2.2 睾丸组织丙二醛水平测定 将睾丸组织在1.5%氯化钾溶液中搅匀，制成10%组织匀浆。用硫代巴比妥酸法测定睾丸组织中丙二醛水平。

2.3 睾丸生精功能分析 通过检测睾丸重量和每日精子产量评估睾丸生精功能。左侧睾丸切下后称重，然后在50mL溶液（含0.5%聚乙二醇辛基苯基醚、0.154M氯化钠﹑伊红溶液和2%叠氮钠）中搅匀。用血细胞计数板测量精子细胞核数目，其结果作为每日精子产量。

3 实验结果

3.1 三组大鼠睾丸丙二醛水平比较 相比于对照组，缺血再灌注组睾丸的丙二醛水平显著升高（P＜0.05）；缺血后处理组睾丸的丙二醛水平明显低于缺血再灌注组（P＜0.05），见表1。

3.2 三组大鼠睾丸生精功能比较 缺血再灌注组睾丸的重量和每日精子产量明显低于对照组（P＜0.05）；缺血后处理组睾丸的上述指标显著高于缺血再灌注组（P＜0.05），见表1。

表1 三组大鼠睾丸组织丙二醛水平﹑睾丸重量及每日精子产量比较（±s）

表1 三组大鼠睾丸组织丙二醛水平﹑睾丸重量及每日精子产量比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与缺血再灌注组比较，#P＜0.05

组别对照组缺血再灌注组缺血后处理组只数10 10 10丙二醛水平（nmol/mg）1.45±0.20 2.73±0.34* 1.86±0.29#睾丸重量（g）1.95±0.11 1.10±0.15* 1.62±0.18#每日精子产量（×106/g）22.03±1.97 2.14±0.42* 15.13±1.81#

4 讨论

睾丸扭转复位是一个缺血再灌注过程，在这一过程中，产生了过量的活性氧，如超氧阴离子、过氧化氢等[3]。活性氧产生机制：缺血时，ATP生成减少，导致膜泵功能障碍，大量钙离子进入中性粒细胞内，引起NADPH氧化酶活性增加；再灌注时，大量的氧随血液进入缺血组织，NADPH氧化酶将氧转化为超氧阴离子、过氧化氢等活性氧[4]。活性氧很难直接定量，因为半衰期很短。丙二醛是活性氧引起细胞脂质过氧化的稳定末端产物，通常被作为活性氧的标志[3]。本研究显示，睾丸扭转复位引起睾丸内丙二醛水平显著升高，说明睾丸扭转复位后，产生了过量的活性氧。此外，睾丸扭转复位后，生精功能也严重受损，包括睾丸重量减轻和每日精子产量下降。活性氧能氧化细胞脂质、蛋白和DNA,导致细胞功能障碍，甚至死亡[5]。已有研究证实，睾丸扭转复位后，活性氧的过量产生是引起生精功能损伤的主要原因[3]。因此，减少活性氧的过量产生有利于保护睾丸生精功能。

据报道，再灌注起始阶段，睾丸﹑心肌﹑肾脏﹑肠等脏器的血液灌注量要高于缺血前，被称之为过度灌注[6]。过度灌注导致大量氧进入缺血组织内，引起活性氧过量产生，造成组织损伤[7]。针对这一现象，缺血后处理可以减少缺血脏器在起始阶段的血液灌注量，降低活性氧产生，从而减轻脏器的缺血再灌注损伤。在犬的心肌缺血再灌注实验中运用此法，成功地减轻了心肌的损伤[6]。其他研究者在动物实验中发现，该方法也能减轻肝﹑肾﹑脑等脏器的缺血再灌注损伤[8]。因此，我们尝试使用该方法治疗大鼠睾丸缺血再灌注损伤。结果显示，缺血后处理可明显降低睾丸内的丙二醛水平，提高了睾丸重量和每日精子产量。这表明缺血后处理减少了活性氧产生，保护了睾丸生精功能。

［1］Uyeturk U，Terzi EH，Gucuk A，et al.Prevention of torsioninduced testicular injury by Rhodiola rosea［J］.Urology，2013，82（1）：254.

［2］Cayan S，Saylam B，Tiftik N，et al.Rho-kinase levels in testicular ischemia-reperfusion injury and effects of its inhibitor，Y-27632，on oxidative stress，spermatogenesis，and apoptosis［J］.Urology，2014，83（3）：675.

［3］Bilommi R，Nawas BA，Kusmayadi DD，et al.The effects of glutathione on malondialdehyde expression and seminiferous tubule damage in experimental testicular torsion-detorsion in Wistar rats［J］.J Pediatr Urol，2013，9（6 Pt B）：1059-1063.

［4］Parlaktas BS，Atilgan D，Ozyurt H，et al.The biochemical effects of ischemia-reperfusion injury in the ipsilateral and contralateral testes of rats and the protective role of melatonin［J］.Asian J Androl，2014，16（2）：314-318.

［5］Ozturk H，Ozturk H，Terzi EH，et al.Interleukin 10 reduces testicular damage in experimental testicular ischemia/reperfusion injury［J］.Urology，2014，83（2）：508.

［6］Ozkisacik S，Erdem AO，Durmaz O，et al.The long-term protective effects of short-interval postconditioning in testicular ischemia-reperfusion injury in rats［J］.J Pediatr Surg，2012，47（4）：743-746.

［7］Gozen A，Demiryurek S，Taskin A，et al.Protective activity of ischemic preconditioning on rat testicular ischemia：effects of Y-27632 and 5-hydroxydecanoic acid［J］.J Pediatr Surg，2013，48（7）：1565-1572.

［8］Minutoli L，Irrera N，Squadrito F，et al.Effects of ischaemic post-conditioning on the early and late testicular damage after experimental testis ischaemia-reperfusion［J］.Andrology，2014，2（1）：76-82.

（收稿：2014-09-07 修回：2014-09-14）

Effect of Ischemic Post-Conditioning on Testicular Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

CHEN Biyao,LIBin,WEI Siming,WANG Li. Department of Clinical Medicine,Zhejiang Medical College,Hangzhou(310053), China

Objective To investigate the effect of ischemic post－conditioning on testicular ischemia－reperfusion (IR)injury in rats.Methods Sixty adult male Sprague－Dawley rats were randomly divided into three groups:control group,IR group,and ischemic post－conditioning group,with 20 rats in each group.Control group underwent a sham operation on the left testis.In IR group,the left testis was rotated 720°for 2h,then detorsion was performed.In ischemic post－conditioning group,the left testis was rotated 720°for 2h,then ischemic post－conditioning was performed.First,testicular detorsion was done for 10－second blood flow reperfusion.Then,the left testis was rotated 720°again for 10－second ischemia.Such procedures were repeated 6 times.Lastly,testicular detorsion was performed for persistent blood flow reperfusion.One half of the rats in each group were sacrificed at 4h after detorsion,and left orchiectomy was done for measurement of malondialdehyde level.The remainder were killed at 3 months after detorsion,and left orchiectomy was performed for analysis of testicular spermatogenesis.Results Testicular torsion－detorsion caused a significant increase in the malondialdehyde level in the testes（2.73±0.34 vs 1.45± 0.20mmol/mg,P＜0.05）and a significant decrease in testicular spermatogenesis[（2.14±0.42）×106vs（22.03±1.97）× 106,P＜0.05].Ischemic post－conditioning significantly decreased malondialdehyde level in testes（1.86±0.29 vs 2.73± 0.34mmol/mg,P＜0.05）,and improved testicular spermatogenesis[（15.13±1.81）×106vs（2.14±0.42）×106,P＜0.05].Conclusion Ischemic post－conditioning has a protective effect on testicular ischemia－reperfusion injury.The effect is related to reduction in production of reactive oxygen species in testes.

rats；testicular ischemia－reperfusion injury；ischemic post－conditioning；testicular torsion－detorsion

浙江医学高等专科学校临床医学系（杭州 310053）

韦思明，Tel：15268133671；E－mail：wsm1971@hotmail.com