雷公藤红素诱导人骨肉瘤细胞系HOS凋亡及机制研究

朱 韬 郑有卯

雷公藤红素诱导人骨肉瘤细胞系HOS凋亡及机制研究

朱 韬 郑有卯

目的 探讨雷公藤红素对人骨肉瘤细胞HOS的杀伤作用及其机制。方法 将人骨肉瘤细胞HOS用各种不同浓度的雷公藤红素治疗后，采用MTT法检测雷公藤红素对HOS细胞活力的抑制作用；采用流式细胞术检测HOS细胞凋亡及活性氧簇（ROS）的产生情况；Western blot检测HOS细胞cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表达水平。结果 雷公藤红素对HOS细胞活力的抑制效应呈剂量依赖性，1、2、3、4、5μmol/L的雷公藤红素组细胞活力抑制率分别为（23.6±3.5）%、（43.7±5.4）%、（57.8±6.9）%、（75.5±6.4）%、（83.7±7.3）%，各雷公藤组细胞活力抑制力与对照组的零抑制力比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；雷公藤红素可显著诱导HOS细胞发生凋亡，与对照组凋亡率（2.3±0.5）%比较，1、3μmol/L雷公藤红素组凋亡率分别为（17.2±2.2）%（P＜0.05）、（39.5±3.6）%（P＜0.05）。雷公藤红素可显著诱导HOS细胞ROS的产生，与对照组ROS阳性率（1.3±0.4）%比较，1、3μmol/L雷公藤红素组ROS阳性率分别为（13.6±1.5）%（P＜0.05）、（29.4±3.3）%（P＜0.05）。雷公藤红素处理后HOS细胞cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表达水平均显著上升。结论 雷公藤红素或通过ROS/JNK途径诱导人骨肉瘤细胞发生caspase依赖的凋亡。

人骨肉瘤细胞HOS；雷公藤红素；凋亡；活性氧簇ROS

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于儿童和青少年时期，很容易发生局部浸润和早期全身性转移[1]。通过手术及多种化疗药物密集疗法，骨肉瘤患者的5年存活率可以达到60%。然而由于高剂量化疗药物的毒副作用明显，限制了化疗治疗的发展，过去30年骨肉瘤的5年存活率一直无法提高[2]。本研究中，笔者通过研究雷公藤红素抑制人骨肉瘤细胞系HOS的分子机制，探讨雷公藤红素抑制骨肉瘤细胞细胞活力并使其发生凋亡的作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞系HOS购于美国ATCC（AmericanTypeCultureCollection），肿瘤细胞培养在RPMI-1640培养基中，含10%胎牛血清，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。

1.2 实验试剂 RPIM-1640培养基和胎牛血清购自于Gibco公司，雷公藤红素（celastrol）、二氢乙啶、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、SP600125（SP）、噻唑蓝（MTT）、AnnexinⅤ凋亡试剂盒购自美国sigma公司。β-actin、cleavedcaspase-3（激活型caspase-3）、cleavedcaspase-9（激活型caspase-9）、p-JNK（激活型磷酸化JNK）抗体购自美国Cellsignal公司。

1.3 MTT试验 将HOS细胞按5×103/孔接种于96孔板，分别加入1、2、3、4、5μmol/L的雷公藤红素，对照组不加药物，所有组别设置3个复孔。培养48h后加入5mg/mLMTT20μL，继续培养4h。弃上清，加二甲亚枫溶解细胞并显色，震荡使紫色絮状物完全溶解，570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率计算公式：抑制率=（OD对照组-OD实验组）/ OD对照组×100%。

1.4 细胞凋亡试验 在HOS细胞中分别加入1μmol/L、3μmol/L的雷公藤红素，对照组不加药物，所有组别设置3个复孔。培养4h后将细胞用生理盐水洗涤2次，按照凋亡试剂盒说明书步骤将Annexin-V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，细胞凋亡率用Annexin-V阳性细胞占所有细胞比值表示。

1.5 ROS（活性氧簇）检测 在HOS细胞中分别加入1、3μmol/L的雷公藤红素，对照组不加药物，所有组分别设置3个复孔。培养48h后将细胞用生理盐水洗涤2次，将5μM二氢乙啶加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞ROS的产生。ROS阳性细胞发射红色荧光，因此肿瘤细胞ROS阳性率以发出红色荧光的细胞占所有细胞比值表示[7]。

1.6 Westernblot试验 在HOS细胞中分别加入1、3μmol/L的雷公藤红素，对照组不加药物。培养48h后将细胞用生理盐水洗涤2次，之后将细胞裂解，将蛋白裂解液用12.5%SDSPAGE进行分离，之后通过电转方法将蛋白质转到PVDF膜上。将膜放入β-actin、cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9、p-JNK一抗稀释液中孵育过夜，之后再用二抗稀释液孵育2h后在X线胶片上进行曝光，之后用ImageJ图像处理软件进行处理，使蛋白表达灰度值用数字表示，目标蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/相应β-actin内参蛋白灰度值。

1.7 统计学方法 所有实验重复3次，实验数据用均值±SD（±s） 表示并用SPSS13.0统计分析软件进行处理，采用非配对双边t检验以及单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤红素对人骨肉瘤细胞系HOS的抑制作用 雷公藤红素有显著的体外抗骨肉瘤作用，不同浓度雷公藤红素的作用下，HOS细胞活力均受到显著抑制，雷公藤红素对HOS细胞活力的抑制效应呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 雷公藤红素对HOS骨肉瘤细胞的抑制作用（±s）

表1 雷公藤红素对HOS骨肉瘤细胞的抑制作用（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与1μmol/L雷公藤红素组比较，#P＜0.05；与2μmol/L雷公藤红素组比较，△P＜0.05；与3μmol/L雷公藤红素组比较，&P＜0.05；与4μmol/L雷公藤红素组比较，○P＜0.05

2.2 雷公藤红素诱导HOS发生caspase依赖的凋亡

3μmol/L和1μmol/L雷公藤红素均能诱导HOS发生凋亡，同时激活caspase-8和caspase-3，当用caspase特异性抑制剂zVAD-fmk[3]抑制HOS细胞caspase的活性后，雷公藤红素对HOS细胞的凋亡诱导效应受到抑制，表明雷公藤红素能诱导骨肉瘤细胞发生caspase介导的凋亡，见表2。

2.3 雷公藤红素通过ROS/JNK/caspase途径诱导HOS细胞凋亡 高低浓度的雷公藤红素均能显著诱导HOS细胞ROS的产生和JNK（c-JunN-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶）的活化。当在HOS细胞培养体系中加入ROS清除剂NAC[4]（N-乙酰半胱氨酸）后，ROS阳性率和HOS细胞凋亡率均明显下降（P＜0.05），JNK的活化也同时受到抑制。当在HOS培养体系中加入JNK特异性抑制剂SP600125[5]（SP，也称Anthrapyrazolone）后，雷公藤红素无法诱导细胞凋亡和JNK的活化，但对ROS的产生无影响。见表3。

3 讨论

雷公藤红素是一种从中药雷公藤中提取的三萜类化合物，目前临床上主要用于自身免疫性疾病和神经退行性疾病[6-7]。最近的研究发现雷公藤红素有显著抗肿瘤效应，如雷公藤红素能通过线粒体-细胞色素C途径诱导肝癌细胞发生凋亡；雷公藤红素能通过下调乳腺癌细胞MMP-9的表达，抑制乳腺癌的转移和侵袭；雷公藤红素还能通过激活JNK/ATF2途径，提高顺铂对肺癌细胞的杀伤活性等[8-10]。这些结果均提示雷公藤红素对多种类型的肿瘤都有很好的治疗效果。然而雷公藤红素抗肿瘤的其它分子机制至今仍不十分清楚，而且其对骨肉瘤是否有治疗作用目前还未有过报道。本研究通过体外实验，证实雷公藤红素能有效抑制骨肉瘤细胞系HOS的细胞活力，并且通过激活caspase-9和caspase-3诱导肿瘤细胞发生凋亡。

表2 雷公藤红素对HOS细胞的凋亡诱导效应（±s）

表2 雷公藤红素对HOS细胞的凋亡诱导效应（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与1μmol/L雷公藤红素组比较，△P＜0.05；与3μmol/L雷公藤红素组比较，#P＜0.05

组别对照组1μmol/L雷公藤红素组3μmol/L雷公藤红素组1μmol/L雷公藤红素+zVAD-fmk组3μmol/L雷公藤红素+zVAD-fmk组孔数雷公藤红素浓度（μmol/L）zVAD-fmk浓度（μmol/L）33333 01313 0001 0 10灰度比（cleaved caspase-9/β-actin）0.04±0.01 0.23±0.04* 0.55±0.07* 0.10±0.03△0.16±0.04*#灰度比（cleaved caspase-3/β-actin）0.02±0.01 0.28±0.06* 0.67±0.08* 0.12±0.03*△0.21±0.06*#凋亡率（%）2.3±0.5 17.2±2.2* 39.5±3.6* 5.5±0.7△9.2±1.3*#

表3 雷公藤红素对HOS细胞ROS/JNK通路影响（±s）

表3 雷公藤红素对HOS细胞ROS/JNK通路影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与1μmol/L雷公藤红素组比较，△P＜0.05；与3μmol/L雷公藤红素组比较，#P＜0.05；NAC：N-乙酰半胱氨酸；ROS：活性氧簇

组别对照组1μmol/L雷公藤红素组3μmol/L雷公藤红素组1μmol/L雷公藤红素+NAC组3μmol/L雷公藤红素+NAC组1μmol/L雷公藤红素+SP组3μmol/L雷公藤红素+SP组孔数 雷公藤红素浓度（μmol/L）NAC浓度（mmol/L）SP浓度（μmol/L）3333333 0131313 0001 0 10 00 000005 0 50 ROS阳性率（%）1.3±0.4 13.6±1.5* 29.4±3.3* 4.2±0.6△9.5±1.3*#14.5±1.6* 28.4±3.8*灰度比（p-JNK/β-actin）0.09±0.01 0.46±0.06* 0.78±0.10* 0.18±0.04△0.27±0.05*#0.14±0.03△0.19±0.05*#凋亡率（%）2.1±0.4 18.3±2.4* 42.3±4.0* 6.3±0.7*△15.4±1.6*#5.7±0.4△13.8±1.4*#

活性氧簇ROS是细胞代谢的副产物，少量的ROS有助于促进细胞的增殖和分化，然而过量的ROS能对细胞内的脂类、蛋白质和DNA造成氧化损伤[11-12]。有文献[13]表明，相比于正常细胞，肿瘤细胞往往处于高氧化应激状态，其对ROS浓度的升高更敏感。此外，ROS还可激活下游信号通路（如MAPK通路）诱导细胞发生凋亡。JNK是MAPK蛋白家族的重要成员，与细胞的程序性死亡有关。研究[14]表明，JNK的激活能显著诱导肿瘤细胞发生凋亡。本研究发现雷公藤红素能显著诱导骨肉瘤细胞ROS的产生和JNK的活化。当用NAC清除ROS后，雷公藤红素的凋亡诱导效应及JNK的活化作用也丧失；而当用SP阻断JNK的磷酸化后，雷公藤红素对HOS的凋亡诱导效应丧失，但对ROS的产生不受影响。结果证明雷公藤红素对骨肉瘤细胞凋亡的诱导作用依赖ROS的产生和JNK的活化，而ROS是JNK的上游分子。

综上所述，雷公藤红素有良好的体外抗骨肉瘤作用，其分子机制可能为通过ROS/JNK途径诱导人骨肉瘤细胞发生caspase依赖的凋亡。这些实验结果为雷公藤红素治疗肿瘤的临床应用提供了理论依据。

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（收稿：2015-03-26 修回：2015-04-28）

Celastrol Induces Apoptosis in Human Osteosarcoma Cell Line HOS and the Underlying M echanism

ZHUTao,ZHENG Youmao.Department of Orthopedics,Engze MedicalCenter Luqiao Hospital,Taizhou(318050),China

Objective To explore the anti-tumor effect of celastrol on human osteosarcoma（HOS）cells and the underlying mechanism.M ethods HOS cells were treated with various concentrations of celastrol,and then the cell viability was measured by using MTT assay.Apoptosis induction and ROS production were determined by flow cytometry.The expression of cleaved caspase-9,cleaved caspase-3 and phospho-JNK were evaluated by western blotting.Results The viability of HOS cells were significantly inhibited by celastrol treatment in a dose-dependent manner,and the inhibition rate was as follows:23.6%±3.5%in 1μmol/Lcelastrol group,43.7%±5.4%in 2μmol/L group,57.8%±6.9%in 3μmol/Lgroup,75.5%±6.4%in 4μmol/L group,83.7%±7.3%in 5μmol/Lgroup（all P＜0.05）. Celastrol treatment significantly induced apoptosis in HOS cells,and the apoptotic rate was significantly different between control group and 1μmol/L and 3μmol/L celastrol groups（2.3%±0.5%vs 17.2%±2.2%and 39.5%±3.6%, P＜0.05）.The ROS positive rate in HOS cells in 1μmol/L and 3μmol/L celastrol groups were significantly higher than that in control group induced（13.6%±1.5%and 29.4%±3.3%vs 1.3%±0.4%,P＜0.05）.Celastrol treatment significantly up-regulated the expression of cleaved caspase-9,cleaved caspase-3,and phospho-JNK in HOS cells. Conclusion Celastrol may induce caspase-dependent apoptotic cell death through ROS/JNKpathway in HOS cells.

human osteosarcoma（HOS）cells;celastrol;apoptosis;ROS

浙江省台州恩泽医疗中心（集团）路桥医院骨科（温岭318050）

郑有卯，Tel：15382362622