甘精胰岛素、地特胰岛素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

汤喻，史祖宣

(河南省人民医院，郑州450003)

人工合成的胰岛素及类似物临床广泛用于2型糖尿病的治疗，通过激活胰岛素受体(IR)、胰岛素生长因子受体1(IGF-1R)及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt)通路发挥调节物质代谢和促有丝分裂作用。有研究发现，IR、IGF-1R及MAPK、PI3K/Akt信号通路的异常可能在某些肿瘤的发生中发挥重要作用［1］;而不同的胰岛素及类似物对乳腺癌、肝癌、结肠癌等肿瘤细胞可产生促进或抑制增殖的作用［2，3］，但其在乳腺癌细胞增殖中的作用研究较少。2010～2014年我们比较了甘精胰岛素和地特胰岛素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7细胞株购于中科院上海生科院细胞库。甘精胰岛素由赛诺菲(北京)制药有限公司提供，地特胰岛素由诺和诺德(中国)制药有限公司提供。MTT试剂盒、碘化丙啶(PI)、MAPKK1抑制剂PD98059、PI3K抑制剂LY294002、Akt、磷酸化 Akt(p-Akt)(ser473)、Erk1/2、磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养 从液氮罐中取出冻存细胞1支，迅速置于37℃水浴中，并轻轻摇动令其内容尽快融化。待细胞悬液融化，消毒管口，超净台内打开冻存管盖，用吸管吸出细胞悬液移至离心管中，补加1 mL含10%FBS的RPMI 1640培养液，吹打使细胞悬浮。室温，1 500 r/min，离心 3 min，弃上清，重新加入 1 mL含10%FBS的RPMI 1640培养液，吹打重悬细胞，接种至培养瓶中，补足含10%FBS的 RPMI 1640培养液，于37℃、5%CO2恒温培养箱中松盖培养。次日换液1次，以后根据细胞生长状态1～3 d换液。吸光培养瓶中的培养液，加入1～2 mL 0.25%的胰蛋白酶液静置3～5 min，加入含10%FBS的RPMI 1640培养液。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。吸取少许细胞悬液，接种于新的培养瓶内，加适量含10%FBS的RPMI 1640培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内，放入培养箱中培养。次日换液1次，以后根据细胞生长状态1～3 d换液。取对数生长期细胞进行实验。

1.3 细胞增殖检测 采用MTT法。取对数生长期细胞，以3×103个/孔接种于96孔板，并贴壁培养24 h。行以下处理:①1 U/L甘精胰岛素或地特胰岛素作用24、48、72、96 h;②10、100、1 000 U/L 甘精胰岛素或地特胰岛素作用48 h;③1 U/L甘精胰岛素 +20 μmol/L PD98059、1 U/L 甘精胰岛素 +10 μmol/L LY2904002作用48 h。以上均设正常对照组。每孔加入MTT液10 μL，培养4 h。吸弃孔内液体，加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL，震荡摇匀10 min，酶标仪于490 nm处测各孔吸光度值(OD值)计算细胞增殖活力。

1.4 细胞周期检测 采用流式细胞仪检测。细胞以8×104个/孔接种于6孔板，并贴壁培养48 h，10 U/L甘精胰岛素或地特胰岛素作用24 h，设立正常对照组。收集细胞，PBS洗2次，离心后的细胞沉淀用300 μL PBS重悬，逐滴加入700 μL无水乙醇，4℃避光过夜。PBS洗2次，PI染液染色，4℃避光30 min，流式细胞仪测细胞周期。

1.5 Erk1/2、Akt磷酸化程度检测 采用Western blotting法。细胞以8×104个/孔接种于6孔板，贴壁48 h，10 U/L甘精胰岛素或地特胰岛素作用24 h，设立正常对照组。提取蛋白，BCA法测蛋白浓度，蛋白浓度调至4.0 μg/μL，5 ×上样缓冲液混合，沸水煮10 min，冷却后25 μL上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转至PVDF膜，封闭2 h，一抗摇床4℃孵育过夜，洗膜3次后二抗孵育1 h。洗膜3次后DAB显色。采用VisionWorkLS软件分析磷酸化程度。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，多组定量资料比较用单因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和检验，组间两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同作用时间甘精胰岛素、地特胰岛素对MCF-7细胞增殖的影响 1 U/L甘精胰岛素或地特胰岛素作用24 h均未引起MCF-7细胞增殖;1 U/L甘精胰岛素作用48、72、96 h均引起MCF-7细胞增殖，呈时间依赖关系(P＜0.05);地特胰岛素增殖作用不明显。见表1。

表1 1 U/L甘精胰岛素、地特胰岛素作用MCF-7细胞24、48、72、96 h增殖水平比较(±s)

表1 1 U/L甘精胰岛素、地特胰岛素作用MCF-7细胞24、48、72、96 h增殖水平比较(±s)

注:与对照组同时点比较，*P＜0.05;与地特胰岛素组同时点比较，#P＜0.05;与同组96 h比较，△P＜0.05。

组别细胞增殖活力24 h 48 h 72 h 96 h对照组 0.233 4±0.011 4 0.237 3±0.010 5 0.301 7±0.014 50.315 5±0.022 0地特胰岛素组 0.217 2±0.010 5 0.251 1±0.010 2 0.309 3±0.014 7 0.347 3±0.039 9甘精胰岛素组 0.222 8±0.010 6 0.302 9±0.012 9*#△ 0.372 2±0.015 1*#△ 0.456 7±0.025 1*#

2.2 不同浓度甘精胰岛素或地特胰岛素对MCF-7细胞增殖的影响 培养48 h后，甘精胰岛素10、100、1 000 U/L均引起MCF-7细胞增殖，呈浓度依赖关系(P＜0.05);地特胰岛素则增殖作用不明显。见表2。

表2 不同浓度甘精胰岛素、地特胰岛素作用MCF-7细胞48 h 增殖水平比较(±s)

表2 不同浓度甘精胰岛素、地特胰岛素作用MCF-7细胞48 h 增殖水平比较(±s)

注:与对照组同浓度比较，*P＜0.05;与地特胰岛素组同浓度比较，#P＜0.05;与同组1 000 U/L比较，△P＜0.05。

组别胰岛素细胞增殖活力10 U/L胰岛素 100 U/L胰岛素 1 000 U/L对照组0.195 7±0.006 5 0.195 7±0.006 5 0.195 7±0.006 5地特胰岛素组 0.206 6±0.007 6 0.215 7±0.007 6 0.226 2±0.007 3甘精胰岛素组 0.259 2±0.007 2*#△0.267 2±0.006 9*#△0.300 7±0.017 9*#

2.3 10 U/L甘精胰岛素或地特胰岛素作用MCF-7细胞24 h细胞周期变化 对照组S+G2/M期细胞(27.316 7±5.597 7)%、地特胰岛素组S+G2/M期细胞(30.036 7±2.707 1)%、甘精胰岛素组S+G2/M期细胞(37.996 7±6.278 1)，甘精胰岛素组反映增殖活性的S+G2/M期细胞明显高于对照组(P＜0.05)，而地特胰岛素对细胞增殖作用不明显。

2.4 10 U/L甘精胰岛素、地特胰岛素作用MCF-7细胞24 h Erk1/2和Akt磷酸化程度 对照组Erk、Akt磷酸化程度分别为(44.41±5.97)%、(47.78±1.09)%，地特胰岛素组分别为(54.27±10.06)%、(51.63±2.02)%，甘精胰岛素组分别为(66.07±5.20)%、(56.53±4.37)%。甘精胰岛素组MCF-7细胞Erk1/2、Akt磷酸化程度较对照组升高(P均＜0.05)，而地特胰岛素组升高不明显。

2.5 1 U/L甘精胰岛素联合抑制剂作用MCF-7细胞48 h细胞生长情况 MCF-7细胞中，1 U/L甘精胰岛素+PD98059、1 U/L甘精胰岛素 +LY294002作用MCF-7细胞48 h，其细胞OD值分别为0.175 0±0.002 3、0.192 0 ±0.001 6，明显少于甘精胰岛素组、对照组(0.242 4±0.007 7、0.203 4±0.003 8，P均＜0.05)，但甘精胰岛素+PD98059组细胞数目减少更明显(P＜0.05)。

3 讨论

MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路是人体内重要的信号通路，能够促进肿瘤细胞增殖和肿瘤血管形成，抑制肿瘤细胞凋亡，增强肿瘤侵袭性，在肿瘤发生、发展和转移中起重要作用［4，5］。2型糖尿病患者肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌等肿瘤发病风险增高［6］，主要与 IR、IGF-1R 及下游 MAPK、PI3K/Akt信号通路的激活有关［1］。2型糖尿病导致胰岛素抵抗和高胰岛素血症，高胰岛素水平减少胰岛素样生长因子结合蛋白-1和胰岛素样生长因子结合蛋白-2，使游离的有生物活性的IGF-1增多［7］。胰岛素、IGF-1激活IR、IGF-1R。IR和IGF-1R有极其相近的信号转导通路［8］，即MAPK、PI3K/Akt信号通路，共同在高胰岛素血症下的恶性细胞增殖中发挥作用。近年来，大量研究报道2型糖尿病治疗药物二甲双胍［9］、胰岛素及类似物［2，3］、噻唑烷二酮类［10］、磺脲类［11］等可通过调节MAPK和(或)PI3K/Akt信号通路影响肿瘤细胞生长。2型糖尿病治疗药物与肿瘤风险的关系引起了高度关注。

甘精胰岛素是在人胰岛素B链C端增加2个精氨酸并用甘氨酸取代A链21位门冬氨酸后得到的胰岛素类似物;地特胰岛素是去除人胰岛素B链30位苏氨酸，并在B链29位赖氨酸上增加一个肉豆蔻酸侧链得到的胰岛素类似物。二者分子结构的不同，决定了它们对于IR、IGF-1R的亲和力不同。Kurtzhals等［12］研究认为地特胰岛素与IR的亲和力比人胰岛素稍低;地特胰岛素与IGF-1R的亲和力比人胰岛素降低5倍，甘精胰岛素与IGF-1R的亲和力是人胰岛素的6.5倍。因此不同的胰岛素及类似物对肿瘤细胞生长的影响可能不同。经过大规模的流行病学调查后，Hemkens等［13］报道，相同用量下甘精胰岛素导致肿瘤的风险高于人胰岛素。Dejgaard等［14］报道2型糖尿病患者使用地特胰岛素患肿瘤的风险比使用鱼精蛋白锌胰岛素或甘精胰岛素者降低或相当。而乳腺癌细胞的体外实验发现，甘精胰岛素和地特胰岛素对乳腺癌细胞株MCF-7有明显地促进增殖作用。

本研究发现，甘精胰岛素对MCF-7细胞促增殖作用明显，地特胰岛素对细胞促增殖作用不明显，两药差异有统计意义。二者对MCF-7细胞增殖作用的差异可能是因为两药对IR、IGF-1R的亲和力不同。两药以1 U/L作用MCF-7细胞24 h，均未引起细胞增殖，但甘精胰岛素以1 U/L作用48 h可以引起细胞增殖，甘精胰岛素10 U/L作用24 h S+G2/M期细胞增多，证实甘精胰岛素对MCF-7细胞增殖作用呈浓度、时间依赖关系。两药10 U/L作用24 h Erk1/2和Akt磷酸化程度增高，而地特胰岛素组与对照组比较差异无统计意义，说明在甘精胰岛素引起细胞增殖过程中，MAPK、PI3K/Akt通路均被激活。使用抑制剂后MCF-7细胞数目减少，但Erk1/2被阻断后细胞数目减少更明显，说明MAPK通路在甘精胰岛素引起MCF-7细胞增殖的过程中发挥更为重要的作用。

综上所述，甘精胰岛素对乳腺癌MCF-7细胞增殖作用明显，而地特胰岛素增殖作用不明显，其机制可能为二者对IR、IGF-1R亲和力不同。在甘精胰岛素促进MCF-7细胞增殖的过程中，MAPK和PI3K/Akt通路均被激活，但MAPK通路更重要。

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