结核分枝杆菌Rv1419蛋白抗原表位的预测

刘银萍 王全立 张俊仙 梁艳 阳幼荣 白雪娟 吴雪琼



·论著·

结核分枝杆菌Rv1419蛋白抗原表位的预测

刘银萍 王全立 张俊仙 梁艳 阳幼荣 白雪娟 吴雪琼

目的 预测结核分枝杆菌Rv1419蛋白的抗原表位。方法 利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv1419氨基酸序列进行分析，采用包括二级结构、亲水性、抗原性、可及性、柔韧性、电荷分布等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位。结果 Rv1419蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段，含有少数潜在的B细胞抗原肽表位(可能在67～70、72～82、142～154、131～137位氨基酸残基或其附近)，这些表位抗原性较好，都含有β转角和无规则卷曲结构，呈现在表面的可能性和柔韧性都较大。该蛋白含有较多潜在的T细胞抗原肽表位(可能在5～15、18～22、29～32、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、110～114、117～123、126～128、136～140位氨基酸残基或其附近)。结论 结核分枝杆菌Rv1419蛋白是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原，也存在B细胞抗原表位，本研究结果为该蛋白抗原表位的进一步研究、应用奠定了基础。

表位； 细菌蛋白质类； 蛋白质结构, 二级； 结核分枝杆菌

目前，Mtb标准菌株H37Rv和临床株CDC1551全基因组测序均已完成，但对Mtb感染后如何与宿主相互作用尚不十分清楚。Mtb抗原能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物(如抗体和致敏淋巴细胞)在体外结合，发生免疫效应。宿主免疫细胞通过其表面受体识别的并不是整个蛋白质抗原分子，而是抗原肽分子中由特殊的化学基团组成的结构，即表位(epitope)，又称为抗原决定簇(antigenic determinant)。一个蛋白质抗原不仅含有B细胞、T细胞[辅助性T细胞(T helper cell,Th细胞)、CD8+、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)]等和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)与免疫识别密切相关的表位结构，也含有一些对于保护性免疫不利的表位结构。因此，抗原优势表位的筛选和鉴定对表位疫苗的研制具有重要的意义，Mtb蛋白抗原表位的免疫学特性成为当前研究的热点之一。

图1 结核分枝杆菌Rv1419蛋白二级结构和抗原表位预测

Mtb Rv1419基因全长474 bp，编码157个氨基酸，蛋白等电点4.1155，预测相对分子质量为16 853(16.853 kDa)，成熟蛋白相对分子质量为13 600(13.6 kDa)[1]。其N端含有33个氨基酸的信号肽(MGELRLVGGVLRVLVVVGAVFDVAVLNAG-AASA)，存在于H37Rv株的培养滤液中，可能是分泌蛋白[2-4]。生物信息学分析显示，Rv1419蛋白可能是凝集素或凝集素样分子[1,5]，这种凝集素可以调节多种生物过程，比如细胞与细胞间的黏附、细胞的有丝分裂和固有免疫过程等，尤其是在宿主-病原体相互作用中发挥重要作用。因此，本研究首次应用DNAStar生物信息学软件对Mtb Rv1419蛋白进行抗原表位预测，为今后进一步的深入研究和应用，尤其是疫苗和免疫诊断试剂的开发奠定理论基础。

材料和方法

1. 抗原表位分析软件：DNAStar软件包是DNASTAR有限公司开发的生物软件，可在计算机上进行DNA和蛋白质分析。用DNAStar软件包中Protean软件对蛋白的二级结构和抗原表位进行分析和预测[6]。

2. Mtb Rv1419蛋白氨基酸全序列(157个氨基酸残基)：见图1。

3. Rv1419蛋白二级结构的预测：采用Gamier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Coiled Coil方法预测Rv1419蛋白二级结构。Gamier-Robson方法是通过计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性来预测蛋白质二级结构；Chou-Fasman方法是通过序列氨基酸残基的晶体结构来预测蛋白质二级结构；Coiled Coil方法是预测跨膜区的阿尔法螺旋。

4. Rv1419蛋白抗原表位的预测：用Kyte-Doolittle方法、Hopp-Woods方法和Eisenberg方法对Rv1419蛋白的疏水性和亲水性进行了分析；用Emini方法预测蛋白的表面可能性；用Karplus-Schulz方法预测蛋白质骨架区的柔韧性；以Jameson-Wolf方法预测蛋白潜在的抗原表位，以AMPHI方法预测蛋白免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点，以Rothbard-Taylor方法预测含有特定基序(motif)的潜在 T 淋巴细胞抗原表位，以Sette MHC Motifs方法预测短肽上与老鼠 MHC Ⅱ d 型蛋白质相互作用的抗原位点，最后综合评价Rv1419蛋白抗原表位。

结 果

1.Rv1419蛋白二级结构和抗原表位预测：见图1。

2. Rv1419蛋白二级结构的预测：蛋白质的二级结构与其B细胞表位的分布关系密切。综合采用Gamier-Robson、Chou-Fasman和Coiled Coil共3种方法预测Rv1419蛋白二级结构的结果显示，α螺旋结构形成在10～15、18～26、37～40、95～99氨基酸残基，数量较少，不存在跨膜区的α螺旋结构；β折叠数量较多，分布较均匀(位于1～27、33～50、56～62、68～72、79～84、88～93、96～101、103～107、111～115、118～130、137～141、153～156氨基酸残基)，其中在4～26、56～61、125～130、138～141氨基酸残基的分值较高。该蛋白在各β折叠单元之间存在较多长短不一的转角；在28～29、73～77、85～86、94～95、132～135氨基酸残基存在无规则卷曲。

3．Rv1419蛋白的亲水性分析：用Kyte-Doolittle方法对Rv1419蛋白的疏水性和亲水性进行了分析，结果显示：Rv1419蛋白存在7个疏水性区域(位于2～30、43～52、56～63、83～89、91～94、121～123、125～131氨基酸残基)和6个亲水性区域(36～42、53～55、64～82、105～114、116～120、132～157)。亲水性区域提示其暴露于表面的概率较大，作为抗原表位的可能性也最大。

4. Rv1419蛋白的表面可能性和柔韧性分析：Rv1419蛋白呈现在表面可能性较大的区域主要是在38～40、67～70、72～79、147～154氨基酸残基，其他部位展示的可能性较小或表现为负值。

Rv1419蛋白含有较多的柔韧性区域(位于33～45、50～55、63～70、75～81、86～88、114～123、131～141、145～154氨基酸残基)，且分布比较均匀。提示该蛋白肽段的柔韧性较大，发生扭曲、折叠的概率较高，能形成丰富的二级结构。

5. Rv1419蛋白B细胞和T细胞抗原表位的预测分析：联合上述蛋白质结构及抗原性预测方法，综合分析推测Rv1419蛋白潜在的B细胞抗原表位位于67～70、72～82、142～154、131～137氨基酸残基，若再结合亲水性、表面可及性和柔韧性，前3个多肽亲水性指数比较高，暴露于表面的概率较大，肽段的柔韧性较大，发生扭曲、折叠的概率较高，能形成丰富的二级结构。因此，作为B细胞抗原表位的可能性较大，尤其是蛋白质的C端具有较好的亲水性、表面可及性和柔韧性，将是很好的B细胞抗原表面区域。

潜在的T细胞抗原表位位于5～15、18～22、29～32、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、110～114、117～123、126～128、136～140氨基酸残基，其中9～15、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、119～123、126～128位氨基酸残基可能是免疫优势的辅助性 T 淋巴细胞抗原位点，11～16和28～33位氨基酸残基可能是与小鼠 MHC Ⅱd 型蛋白质相互作用的抗原位点。

讨 论

结核分枝杆菌生长缓慢，天然蛋白抗原的获取较困难，通过基因工程技术获得重组蛋白抗原进行研究应用已成为一个简便、有效的途径。此外，近年来结核病疫苗如重组蛋白疫苗、重组卡介苗、DNA疫苗的研发[7]，有些己经进入临床试验，而生物信息技术的迅猛发展和互联网数据库的开发利用已为确定蛋白优势抗原表位提供了有效的方法，使得研究者不需要克隆整个蛋白，可根据不同的需求有选择地克隆抗原表位，去除了蛋白抗原中的不利因素，使免疫反应集中针对强免疫原性的抗原表位；预测到更可能成为抗原表位的肽段，也就不需要合成许多重叠的多肽段进行筛选、评价，只需根据生物信息学软件的预测结果选择合成不同的多肽，显著降低了候选肽段的数目，减少了合成肽段的费用和体外试验鉴定的工作量；而且缩短了时间，也避免遗漏掉一些较长的抗原表位。利用生物信息学软件的强大功能进行表位预测，将为表位疫苗的发展、免疫诊断制剂的开发开辟新的路径[8]。

DNAStar软件包中Protean软件已被用于蛋白抗原表位的预测[9-10]，如丁淑琴等[10]应用该软件分析结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)二级结构，结果显示其二级结构中含有较多的α螺旋结构(占78%)，β折叠、转角、无规则卷曲较少，分别只有1%、5%和16%。而本研究应用DNAStar软件包中Protean软件对Rv1419氨基酸序列进行分析，预测该蛋白的二级结构与结核分枝杆菌ESAT-6的二级结构明显不同，Rv1419蛋白β折叠、转角的数量较多，而α螺旋结构较少。α螺旋和β折叠化学键键能比较高，形态固定，结构规则不易变形，常处于蛋白质内部，较难结合抗体，一般不作为抗原表位。β转角为凸出结构，与无规则卷曲多出现在蛋白质的表面，结构松散，有利于与抗体结合，较可能成为B细胞抗原表位。

本研究图1清楚地显示了Rv1419蛋白可能的B细胞和T细胞抗原优势表位，发现该蛋白含有较多潜在的T细胞抗原肽表位和少数潜在的B细胞抗原肽表位，是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原，与笔者前期的研究结果及Nogueira等[1]的研究报道一致。Rv1419蛋白具有很好的免疫原性和抗原性，在活动性肺结核患者中，可刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生大量的IFN-γ；在活动性肺结核患者的血清中可检出高滴度的抗Rv1419 IgG抗体；其DNA疫苗免疫小鼠后可在小鼠体内高效表达，并诱导机体产生体液免疫应答和强的细胞免疫应答[11]。鉴于抗结核免疫主要是细胞免疫，该抗原可能在抗结核分枝杆菌感染的保护性免疫应答中发挥重要和独特的作用。本研究结果为该抗原进一步深入研究，使之成为疫苗组分之一或细胞免疫刺激原奠定了理论基础。

但下列几个问题值得注意：(1)应用生物信息学软件预测出来的只是理论优势表位，还需要进一步通过功能试验方法进行验证，如B细胞表位可通过Western blot和ELISA分析其抗原抗体反应亲和力；T细胞表位可通过T 细胞增殖性试验、细胞杀伤实验、流式细胞技术、酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT)技术等鉴定。目前，笔者正在进行Rv1419蛋白潜在的T细胞抗原肽表位的验证工作。(2)应用DNAStar软件包中Protean软件进行表位预测，并不一定完全正确，有些优势表位可能未能预测到，也可能存在预测错误，可多选择几个公认的软件进行预测，然后再合成多肽表位做进一步的体外验证试验。(3)只有少部分B细胞表位是线性表位，绝大部分(约90%)是构象型表位[11]，而DNAStar软件是在氨基酸一级结构的基础上应用多个参数预测B细胞抗原表位，如二级结构、亲水性、抗原性、可及性、柔韧性、电荷分布等，忽略了各氨基酸之间的分子作用力，因此， 对构象依赖的B细胞表位的预测有一定局限性。(4)T细胞表位都是线性表位[12]，但DNAStar软件用于预测T细胞表位的参数较少，也不能进一步预测Th1型T细胞表位和CTL表位，这不利于抗结核疫苗的设计。Zhu等[13]应用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和NetCTL法预测并合成了几个结核分枝杆菌Rv1410c 蛋白的CTL 表位，验证发现天然肽表位Rv1410c-p510 (TLAPQVEPL)和改造的肽表位Rv1410c-p510-1Y9V (YLAPQVEPV)与HLA-A*0201分子均具有较好的亲和力和稳定性，并能够诱导IFN-γ释放，但Rv1410c-p510只能在体外诱导CTL反应，而Rv1410c-p510-1Y9V无论在体外还是在体内均能够诱导CTL反应。因此，笔者将联合应用其他抗原表位预测软件进一步预测T细胞表位，以提高预测的准确度和特异度。

总之，结核分枝杆菌Rv1419是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原，也存在B细胞抗原表位。应用生物信息学软件预测蛋白抗原表位可为蛋白免疫学特性的研究及其应用奠定理论基础。

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(本文编辑：薛爱华)

Prediction of epitopes ofMycobacteriumtuberculosisRv1419 protein

LIU Yin-ping*, WANG Quan-li，ZHANG Jun-xian, LIANG Yan, YANG You-rong, BAI Xue-juan, WU Xue-qiong.

*Department of Blood Transfusion, The Affiliated Hospital of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071, China

Corresponding author： WANG Quan-li，Email：13691110351@163.com WU Xue-qiong，Email：wu-xueqiong@263.net

Objective To predict the epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv1419 protein. Methods The amino acid sequence of Rv1419 protein was input and predicted B cell and T cell epitopes using multi-parameters including the secondary structure, hydrophilicity, antigenicity, accessibility, flexibility, charge distribution by Pro-tean software of DNAStar software package. Results The Rv1419 protein has rich secondary structure and multiple sections with higher antigenicity. There were a few potential B cell epitopes at 67-70, 72-82, 142-154, 131-137 amino acid residues or nearby, these epitopes had better antigenicity, contained beta angle and irregular coil structure, present in the surface probability and had larger flexibility. There also were more potential T cell epitopes of the protein containing at 5-15, 18-22, 29-32, 43-55, 58-62, 64-68, 86-97, 99-109, 110-114, 117-123, 126-128, 136-140 amino acid residues or nearby. Conclusion Mycobacterium tuberculosis Rv1419 protein is a T-cell-epitope dominant antigen, B cell epitopes also exists, which will lay the foundation for its further study and application.

Epitopes； Bacterial proteins； Protein structure, secondary； Mycobacterium tuberculosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.011

100071 北京，军事医学科学院附属医院输血科(刘银萍、王全立)；解放军第三〇九医院全军结核病研究所 全军结核病防治重点实验室[刘银萍(研究生)、张俊仙、梁艳、阳幼荣、白雪娟、吴雪琼]

王全立，Email:13691110351@163.com；吴雪琼，Email: wu-xueqiong@263.net

2014-08-07)