HPLC法测定补肾化瘀浸膏中毛蕊花糖苷的含量

王 娟，汪选斌，李洪亮，欧阳露*

0 引言

补肾化瘀浸膏由淫羊藿、骨碎补、熟地、当归、地鳖虫等五味中药制成，前期动物实验研究证实，该方能够有效调节骨代谢，改变骨吸收大于骨形成的负平衡状态，增加骨量，抑制骨丢失，对原发性骨质疏松症有良好的治疗作用，具有很高的临床应用和开发价值［1-3］。前期质量标准研究只建立了方中淫羊藿、骨碎补的含量测定方法［4-5］。毛蕊花糖苷为方中主药熟地的主要活性成分，属苯丙素苷类化合物，具有多种药理活性［6］。本实验旨在建立补肾化瘀浸膏中毛蕊花糖苷含量测定方法，完善其质量标准，保证临床用药安全有效。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日本岛津高效液相色谱仪(LC-20AD泵、SIL-20A自动进样器、SPD-M20A紫外检测器、LC-Solution色谱工作站);KQ-500PV型数控超声波清洗器，FA2004电子分析天平。

1.2 试药 补肾化瘀浸膏(湖北医药学院附属人民医院，批号:20140213、20140225、20140319)，毛蕊花糖苷对照品(批号:111530-201310，北京浩天永泰科技有限公司，含量:93.3%)，甲醇(分析纯)，乙腈(色谱纯)，流动相用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:ODS Phenomenex Gemini C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。流动相:乙腈－0.1%醋酸溶液(16∶84);流速:1.0 mL/min;检测波长:334 nm;进样量:10 μL，柱温:30 ℃，理论塔板数不低于5 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 毛蕊花糖苷对照品溶液的配制 取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL约含0.3 mg的毛蕊花糖苷溶液，摇匀即得。

2.2.2 熟地对照品溶液的配制 取熟地约10 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，精密称定，超声1 h，放冷至室温，以50%甲醇补足失重，摇匀滤过，续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取补肾化瘀浸膏约12 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，精密称定，超声提取1 h，静置放冷至室温，以50%甲醇补足损失重量，滤过，续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 阴性对照液的配制 按处方和工艺制法制备不含熟地的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制得阴性样品溶液。

2.3 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下制备的毛蕊花糖苷对照品溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流动相定容。分别量取0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，流动相定容摇匀，制得浓度为 1.5、3.0、6.0、15.0、30.0 μg/mL的对照品系列溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，以质量浓度对峰面积进行线性回归，得线性范围和回归方程，毛蕊花糖苷进样量在0.015～0.300 μg之间线性关系良好。回归方程Y=16 763 X－7 948.9，R=0.999 6。

2.4 专属性考察 取“2.2.1”项下毛蕊花糖苷对照品溶液、“2.2.2”项下熟地对照品溶液、“2.2.3”项下供试品溶液和“2.2.4”项下阴性对照品溶液各进样10 μL，分别按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。结果显示供试品溶液中毛蕊花糖苷分离度好，处方中其他成分对毛蕊花糖苷的测定无干扰。色谱图见图1。

图1 补肾化瘀浸膏HPLC色谱图注:A.对照品，B.熟地，C.供试品，D.阴性对照品

2.5 精密度试验 按“2.2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件下进样10 μL，重复6次，以毛蕊花糖苷峰面积计算RSD为0.92%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批补肾化瘀浸膏(批号:20140213)，按“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样10 μL，测定毛蕊花糖苷的峰面积，RSD为1.58%，说明该法重复性好。

2.7 稳定性试验 取同一样品溶液(批号:20140213)，分别在 0、1、2、4、8、12 h 进样 10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算毛蕊花糖苷的含量，RSD为0.34%，说明浸膏供试品溶液12 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知毛蕊花糖苷含量的补肾化瘀浸膏6份，精密称定，置100 mL容量瓶中，精密加入毛蕊花糖苷对照品溶液适量，按“2.2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项色谱条件测定含量，求得毛蕊花糖苷的回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.9 样品含量测定 取3批样品，每批精密称取3份，按“2.2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定含量，结果见表2。

3 讨论

对熟地的质量控制与评价，有文献报道以梓醇含量作为检测指标［7-9］，但梓醇对热不稳定，在熟地中含量极少，不易测出，且在210 nm最大吸收波长处干扰杂质多。近年来对毛蕊花糖苷的药理研究表明其对神经系统、免疫系统均具有明显的药理作用，特别是针对老年痴呆等老年性疾病、慢性肾炎等免疫性疾病具有明显的治疗作用［10］，因此，本实验参考2010版《中国药典》，以毛蕊花糖苷含量作为熟地质量控制标准，建立补肾化瘀浸膏中毛蕊花糖苷的HPLC含量测定方法。实验结果证实，本实验建立的补肾化瘀浸膏中毛蕊花糖苷的HPLC含量测定方法操作简便，精密度高，稳定性良好，可用于补肾化瘀浸膏的质量控制与评价。

表2 样品含量测定结果(n=3)

［1］ 欧阳露，汪选斌，肖雨清，等.补肾化瘀浸膏对去势大鼠血清ALP、E2及IL-6 水平的影响［J］.中国药师，2009，12(10):1342-1344.

［2］ Ouyang L，Zhang Q，Ruan X，et al.Treatment effect of Bushen Huayu extract on postmenopausal osteoporosis in vivo［J］.Exp Ther Med，2014，7(6):1687-1690.

［3］ 欧阳露，汪选斌，国宏莉，等.补肾化瘀浸膏对去势大鼠骨密度及骨组织形态的影响［J］.医药导报，2009，28(12):1533-1535.

［4］ 欧阳露，汪选斌，李洪亮，等.HPLC测定补肾化瘀膏中淫羊藿苷的含量［J］.中国药师，2010，13(1):13-15.

［5］ 欧阳露，夏鹏，李洪亮，等.HPCL法同时测定补肾化瘀浸膏中淫羊藿苷及柚皮苷含量［J］.医药导报，2014，33(9):125-127.

［6］ 许敬英，苏奎，周静.苯丙素苷类化合物的研究进展(Ⅱ)［J］.时珍国医国药，2007，18(7):1770-1772.

［7］ 陈天朝，翟来超.HPLC同时测定地黄中梓醇与毛蕊花糖苷的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(5):105-107.

［8］ 邱建国，张汝学，贾正平，等.HPLC法测定地黄、不同提取物及熟地黄中的梓醇［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(1):23-25.

［9］ 祝巍，张玉萍.HPLC法测定地黄不同炮制品中梓醇的含量［J］.江西中医药，2008，39(11):71-72.

［10］ 边宝林，王宏洁，杨健.5种不同药材中毛蕊花糖苷的含量比较［J］.中国中药杂志，2010，35(6):739-740.