RP-HPLC法同时测定避孕贴中炔雌醇与诺孕曲明的含量

张琳杰，刘景彬，张 启，王 琳，赵永良，谢印芝（天津美伦医药集团有限公司，天津 300400）

避孕贴是一种新型女性避孕工具，主要借助贴剂上的储药区缓慢释放甾体激素，经皮肤渗透进入机体而发挥避孕作用[1-2]。炔雌醇（Ethinylestradiol，EE）是避孕药中最常用的强效雌激素，与孕激素配伍可产生协同作用[3-4]；诺孕曲明（Norelgestromin，NE）是一种孕激素，为炔诺肟酯的活性代谢产物，其与炔雌醇配伍后经透皮吸收，可达到良好的避孕效果[5-7]。目前，同时测定炔雌醇及诺孕曲明含量方法的报道较少。为了更好地控制避孕贴质量，提高检测效率，在本研究中笔者采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定了炔雌醇与诺孕曲明的含量。

1 材料

LC-10A型HPLC仪，包含SPD-10A型紫外检测器、Anastar 5.3色谱工作站（日本岛津公司）；BS110S型电子天平（德国赛多利斯公司）；QYTC-400型超声波清洗器（沧州全一电子设备有限公司）。

避孕贴（天津美伦医药集团有限公司，批号:20140703、20140816、20140908）；炔雌醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号:100052-200609，纯度:99.5%）；诺孕曲明对照品（加拿大多伦多研究化学品公司，批号:D28870，纯度:99.9%）；甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:WondaCract ODS-2（150mm×4.6mm，5 μm）；流动相:甲醇-0.5%磷酸（68∶32，V/V）；流速:1.0ml/min；柱温:25 ℃；检测波长:220nm；进样量:20μl。在此色谱条件下，炔雌醇与诺孕曲明的出峰时间相对较短（＜30min），峰形较好（对称因子均在0.95～1.05之间），两组分的理论板数分别以炔雌醇与诺孕曲明峰计均＞3000，分离度均＞1.5。色谱见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取经105℃加热4 h后的炔雌醇与诺孕曲明对照品各适量，置于同一10ml量瓶中，超声（功率:200 W，频率:45 kHz）处理30min后，用70%甲醇溶解并定容，即得。

2.2.2 供试品溶液 取避孕贴（批号:20140703）1片，除去保护膜剪碎后置于100ml锥形瓶中，加入70%甲醇40ml，浸泡1 h后，超声（功率:200 W，频率:45 kHz）处理30min，提取2次，提取液转入100ml量瓶并用70%甲醇定容，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 按避孕贴制备工艺制备不含炔雌醇与诺孕曲明的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 线性关系考察

图1 高效液相色谱图A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；1.决雌醇；2.诺孕曲明Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference solution；B.test solution；C.negative control solution；1.ethinglestradion；2.nordgestromin

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液 0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0ml，分别置于10ml量瓶中，加70%甲醇稀释并定容，摇匀，制成不同质量浓度的系列溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定并记录峰面积。以峰面积（y）为纵坐标、质量浓度（x，μg/ml）为横坐标进行线性回归，得炔雌醇的回归方程为y＝16418x－11009（r＝0.9996），诺孕曲明的回归方程为y＝17965x+11414（r＝0.9997）。结果表明，炔雌醇、诺孕曲明的质量浓度分别在0.872～130.8、0.880～132.0μg/ml范围内与各自峰面积呈良好的线性关系。

2.4 检测限与定量限

取“2.2.1”项下的混合对照品溶液适量，用流动相逐级稀释，摇匀，滤过，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，以信噪比为3时，测得炔雌醇、诺孕曲明的检测限分别为0.014、0.012μg/ml；以信噪比为10时，测得炔雌醇、诺孕曲明的定量限分别为0.042、0.036μg/ml。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件重复进样9次，记录峰面积。结果，炔雌醇、诺孕曲明峰面积的RSD分别为0.27%、0.17%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品（批号:20140816）适量，分别于放置0、4、8、12、24、48、60、72h时按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，炔雌醇、诺孕曲明峰面积的RSD分别为0.29%、0.35%（n＝9），表明供试品溶液在72h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批次（批号:20140816）避孕贴片1片，按“2.2.2”项下方法各平行制备9份供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，炔雌醇、诺孕曲明含量的RSD分别为1.03%、0.99%（n＝9），表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液（批号:20140816）2ml，各9份，分别加入相当于对照品溶液质量浓度80%、100%、120%的溶液（每个质量浓度3份）各2ml，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果详见表1。

2.9 样品含量测定

取3批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定并记录峰面积，计算样品含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

3.1 流动相的选择

采用2010年版《中国药典》（二部）中检测炔雌醇的流动相[甲醇-水（70∶30，V/V）]对避孕贴供试品溶液进行色谱分离，结果发现炔雌醇分离度较好，但诺孕曲明无法与避孕贴中的药用辅料等其他物质完全分离。笔者通过改变流动相比例、pH、流速等方法，最终确定甲醇-0.5%磷酸（68∶32，V/V）为本研究的流动相。在此条件下，炔雌醇与诺孕曲明分离度良好、峰形较好、出峰时间相对较短。

3.2 样品前处理方法的选择

根据2010年版《中国药典》（二部）及相关文献可知，萜类药物的处理多采用剪碎后溶剂浸泡的方法[8-10]，但该方法所需时间较长且提取率低。本研究结合超声波辅助方法，将样品剪碎浸泡一定时间后超声处理，这样不仅缩短了样品处理时间，且大大提高了样品中有效成分（炔雌醇与诺孕曲明）的提取率。

综上所述，本方法简便、准确，可用于避孕贴中炔雌醇和诺孕曲明的含量测定。

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