基于点击化学的炔雌醇荧光传感器

王春梅，卢丽君，林振宇

(1.龙岩学院化学与材料学院，福建龙岩364000; 2.福州大学化学学院，福建福州350116)

基于点击化学的炔雌醇荧光传感器

王春梅1，卢丽君2，林振宇2

(1.龙岩学院化学与材料学院，福建龙岩364000; 2.福州大学化学学院，福建福州350116)

炔雌醇是一种环境干扰物，高浓度的炔雌醇会对环境、生物等造成一定的伤害.根据Cu(I)可以催化炔雌醇与带叠氮基团的叠氮香豆素之间的点击化学反应(CuAAC反应)，生成具有1，2，3–三唑五元环的大分子结构化合物.由于整个分子中共轭结构的增加，使得反应后体系的荧光信号增强.通过检测反应前后荧光信号的变化，可以实现对炔雌醇的高灵敏检测.在最佳条件下，传感器的相对荧光强度与炔雌醇的质量浓度在0.1～2.5 μg·L－1范围内具有良好的线性关系，检测限为0.05 μg·L－1.

炔雌醇;叠氮香豆素;Cu(I);荧光传感器

0 引言

炔雌醇是重要的人工合成雌激素，属于甾类同化激素中的一种［1］.炔雌醇常用作口服避孕药和促进家畜生长的同化激素，在维持蛋白质副特征和蛋白质同化方面具有重要的作用.但是，如果人体长期大量摄入此激素，则可能使人体的生殖机能和生殖器官出现异常现象，导致性早熟、女性化，抑制骨骼和精子的发育等伤害［2］.另外，炔雌醇还可能通过鱼肉、奶制品等食物危害人体健康，严重者甚至能诱发癌症等疾病［3］.高浓度的炔雌醇同样会影响鱼类等海生生物的染色体表达等，从而对鱼类的繁殖起到一定程度的危害作用，间接给人类带来经济损失和生命伤害.环境内分泌干扰物是指通过干扰生物天然激素的水平，对免疫系统、生物生殖系统等功能产生影响的外源性物质.炔雌醇被认为是一种环境内分泌干扰物，常以药物原形或其代谢产物形式随排泄物排放到环境中.炔雌醇在体内代谢后失活，但在污水中细菌的作用下又会被激活［4］，为重要的环境污染物之一.因此，炔雌醇的副作用引起了社会的广泛关注和研究［5］，对环境土壤或水样中的炔雌醇的含量进行研究检测具有重要意义.

目前检测炔雌醇常用的方法有液相色谱法［6］、质谱法［7－9］、气相色谱－质谱联用法［10］、酶联免疫分析方法［11－12］等.这些检测方法能够较好地实现对炔雌醇的检测并且具有较高的选择性和灵敏度，但色谱分析方法对检测溶液的要求较严格，常常需要复杂、繁琐的前处理步骤［13－14］，并且所使用的检测仪器大型、昂贵，需要专业技术人员操作，需要花费较长的时间进行分析检测，无法实现对炔雌醇的快速检测;而酶联免疫分析方法虽然具有较好的选择性，避免了许多背景物质带来的干扰，但是其实验操作步骤还是相对较繁琐，同样无法实现对炔雌醇的高效、快速检测.因此，有必要设计出一种能够操作步骤简单、快速检测炔雌醇的简便传感器.

炔雌醇分子结构中带有一个端炔基团，因此可以与带有叠氮基团的叠氮香豆素发生CuAAC反应.实验着眼于一种快速且简易检测环境中炔雌醇的研究设想，基于CuAAC反应原理，设计了一种能够快速检测炔雌醇的荧光传感器.将炔雌醇作为CuAAC反应中的反应物之一，其质量浓度大小与反应前后荧光的变化成一定的定量关系，因此通过检测体系荧光信号的变化进而检测炔雌醇，并进行加标回收验证.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

荧光的测定利用Eclipse荧光分析光谱仪(Varian公司，美国)，荧光分析检测实验参数:电压650 V，λex=395 nm(slit 10 nm)，λem=400～550 nm(slit 10 nm).核磁共振波谱仪(AVANCE III 500，Bruker，瑞士)用于核磁共振氢谱检测;质谱采用离子阱质谱仪(DECAX－30000 LCQ Deca XP，ThermoFinnigan，美国)测量;傅立叶红外光谱仪(Nicolet 6700，Thermo Scientific，美国)用于红外光谱扫描.

抗坏血酸钠、五水硫酸铜、2，4－二羟基苯甲醛、N－乙酰基甘氨酸、无水乙酸钠、乙酸酐，以及丙酮购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯;叠氮化钠购自阿尔法埃莎中国有限公司;炔雌醇(EE2)购自上海梯希爱化成工业发展有限公司;3－叠氮基－7－羟基香豆素根据文献报道方法合成［15］.

1.2 实验方法

3－叠氮基－7－羟基香豆素化合物采用Wang课题组提出的方法［15］进行制备，具体步骤如下:分别称取1.38 g 2，4－二羟基苯甲醛和1.12 g N－乙酰甘氨酸、无水乙酸钠至50 mL乙酸酐溶液中，并超声溶解，然后回流搅拌4 h，反应完成后，所得混合物倒入冰水中，得到黄色沉淀，过滤取黄色沉淀，并用冰水清洗沉淀物，然后再在30 mL盐酸和乙醇的混合液(体积比2∶1)中回流1 h，反应完成后，采用冰浴将上述溶液冷却，并用20 mL冰水稀释上述溶液;加入20 mmol亚硝酸钠，搅拌10 min后，再加入30 mmol叠氮化钠，搅拌20 min.经过滤、减压干燥后得到的棕色固体为3－叠氮－7羟基香豆素化合物.

利用叔丁醇溶解叠氮香豆素固体粉末，配制5 mmol·L－1叠氮香豆素溶液.用二次水分别配制1 mmol·L－1硫酸铜溶液和0.1 mol·L－抗坏血酸钠溶液(现配现用).用溶剂丙酮溶解炔雌醇固体粉末，配制不同浓度的炔雌醇溶液.在200 μL的PBS缓冲溶液中先后加入5 μL、5 mmol·L－1叠氮香豆素溶液，5 μL含有不同质量浓度炔雌醇的溶液(包含炔雌醇质量浓度为0的空白对照组溶液)，5 μL、1 mmol·L－1硫酸铜溶液和5 μL、0.1 mol·L－1抗坏血酸钠溶液，振摇混匀后室温下反应1 h.检测反应后溶液的荧光信号.

2 结果与讨论

2.1 实验原理

实验所构建的基于CuAAC检测炔雌醇环境干扰物荧光传感器的实验原理如图1所示.

检测目标物炔雌醇是带有端炔基团的分子化合物，在硫酸铜和抗坏血酸钠存在的条件下，能够与带有叠氮基团的叠氮香豆素发生CuAAC反应，生成具有强荧光信号的化合物.通过检测反应前后荧光信号的变化，达到检测炔雌醇的目的.

2.2 炔雌醇和雌二醇对比研究

为了探究上述设计的传感器的可行性，实验选择了和炔雌醇结构相似、仅比炔雌醇缺少一个端炔基团的另外一种雌性激素雌二醇，进行对照实验.

实验结果如图2(a)所示，随着炔雌醇质量浓度的增大，体系荧光强度逐渐增大;而对于雌二醇，当其质量浓度增大时，体系的荧光强度几乎没有发生变化，如图2(b)所示.该对照实验结果表明，炔雌醇因具有端炔基团而能够同叠氮香豆素发生CuAAC反应，从而使荧光增强，而与炔雌醇结构相似的雌二醇由于不具有端炔基团而无法与叠氮香豆素发生CuAAC反应.因此，上述构建的基于CuAAC检测炔雌醇的传感器原理可行.

2.3 检测条件的优化

为了获得最佳实验检测条件，对实验中影响较大的条件进行了优化.首先，对CuAAC反应的时间进行优化.如图3(a)所示，荧光强度随着反应时间的增加而逐渐增大，当反应时间达到60 min之后，体系的荧光强度趋于稳定.因此，实验选择60 min作为CuAAC反应的时间.然后，对叠氮香豆素的浓度进行优化.如图3(b)所示，随着叠氮香豆素浓度的增大，体系的相对荧光强度(即F/F0，F为不同浓度的叠氮香豆素与炔雌醇反应后溶液的荧光信号，F0为没有炔雌醇参加反应、相应浓度下叠氮香豆素的荧光信号)先增强后减小，当叠氮香豆素浓度为0.125 mmol·L－1时，体系的荧光强度达到最大.出现此趋势现象的原因，可能是因为叠氮香豆素本身具有微弱的荧光，当叠氮香豆素的浓度增大，体系的背景荧光也剧烈增强，导致F/F0的值增大得不够明显甚至减小.因此，实验选择0.125 mmol·L－1作为叠氮香豆素参与反应的浓度.第三，对硫酸铜溶液的浓度进行优化，如图3(c)所示，体系的相对荧光强度(即F/F0，F为不同浓度的Cu(II)参加反应后溶液的荧光信号，F0为没有Cu(II)参加的溶液的荧光信号)随着Cu(II)浓度的增大先是剧烈增大后下降，当Cu(II)浓度为0.25 μmol·L－1时，相对荧光值达到最大.出现此趋势现象的原因可能是过量的Cu(II)会猝灭体系的荧光，使得检测到的荧光信号减小.因此，实验选择0.25 μmol·L－1作为Cu(II)参与反应的浓度.

最后，对还原剂抗坏血酸钠(SA)进行了优化.如图3(d)所示，体系的相对荧光强度(即F/F0，F为不同浓度的抗坏血酸钠参加反应后溶液的荧光信号，F0为没有SA参加的溶液的荧光信号)随着SA浓度的增大先逐渐增大后趋于稳定(略有下降)，当SA浓度大于2.5 mmol·L－1时，荧光强度已基本趋于稳定.因此，实验选择2.5 mmol·L－1作为SA参与反应的浓度.

2.4 线性范围与检测限

在最优条件下，对传感器的线性范围和检测限进行了探究.如图4所示，体系的荧光强度随着炔雌醇质量浓度的增大而增强，并且在0.1～2.5 μg·L－1范围内，体系的相对荧光强度与炔雌醇的质量浓度呈良好的线性关系.线性方程为F/F0=1.202 7+0.343 3 ρ(μg·L－1)(其中F为不同质量浓度的炔雌醇参加反应后溶液的荧光信号，F0为没有炔雌醇参加反应的溶液的荧光信号;ρ为炔雌醇的质量浓度)，如图5所示，相关系数R为0.997 1，传感器的检测限为0.05 μg·L－1.

2.5 传感器的重现性与选择性实验

实验对传感器的重现性做了考察，制备了5组平行检测炔雌醇的传感器(1.0 μg·L－1)，测得实验结果的相对标准偏差(RSD)为4.6%，表明该传感器具有较好的重现性.

为了探究该传感器的选择性，实验选择了除炔雌醇之外的3种不同环境干扰物(己烷雌酚、双酚A、雌二醇)作为干扰实验.如图6所示，己烷雌酚、双酚A、雌二醇对传感器几乎没有荧光响应，只有炔雌醇荧光强度增强(其中己烷雌酚、双酚A、雌二醇的质量浓度均为50 μg·L－1，炔雌醇质量浓度为0.5 μg·L－1).结果表明，该传感器对炔雌醇的检测具有较好的选择性.

2.6 水样添加回收率实验

基于传感器的检测原理，实验对超纯水、自来水、河水(福建闽江)3种水样分别检测了炔雌醇的质量浓度.实验结果如表1所示，采用以上实验检测炔雌醇的方法，3种水样中均未检测出炔雌醇.分别对3种水样做3个不同水平(0.25、0.50、2.5 μg·L－1)的添加回收率实验.得到的回收率为94%～110%，相对标准偏差为4%～7%，实验结果较理想，说明该检测方法在复杂实际样的检测中是可行的.

表1 水样中炔雌醇的检测Tab.1Analysis of ethinylestradiol in water samples

3 结论

利用CuAAC反应，构建一种高选择性、快速检测环境干扰物炔雌醇的荧光传感器.该检测方法的优势在于操作简单、检测快速，无需太多的处理步骤，具有即时性.将该传感器应用于水环境中炔雌醇的检测，结果较理想，具有一定的实用性.

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(责任编辑:洪江星)

Fluorescence sensor for ethinylestradiol based on click chemistry

WANG Chunmei1，LU Lijun2，LIN Zhenyu2
(1.College of Chemistry and Material Science，Longyan University，Longyan，Fujian 364000，China; 2.College of Chemistry，Fuzhou University，Fuzhou，Fujian 350116，China)

Ethinylestradiol is an environmental distractor，high concentrations of ethinylestradiol may cause certain harm to environment and biological.In this study，a selective fluorescent sensor based on click chemistry for ethinylestradiol detection of had been proposed.Ethinylestradiol has the terminal alkyne which can react with 3－azido－7－hydroxycoumarin through Cu(I)catalysed alkyne－azide cycloaddition(CuAAC)reaction to form a strong fluorescent compound.The fluorescence increased factor (represented by F/F0)of the system exhibited a good linear relationship with the mass concentration of ethinylestradiol in the range of 0.1 to 2.5 μg·L－1and the detection limit was 0.05 μg·L－1(S/N=3).

ethinylestradiol;3－azido－7－hydroxycoumarin;Cu(I);fluorescent sensor

TP212.2

A

10.7631/issn.1000－2243.2016.06.0901

1000－2243(2016)06－0901－05

2016－07－04

林振宇(1976－)，研究员，主要从事化学传感器方面的研究，zylin@fzu.edu.cn

国家自然科学基金资助项目(21175024)