不同产地丁公藤药材的HPLC特征图谱对比研究Δ

文婧，孙洪章，卢静华（辽宁医学院研究生学院，辽宁 锦州 121000）

中药丁公藤[1]为旋花科植物丁公藤Erycibe obtusifolia Benth.或光叶丁公藤[2]Erycibe schmidtii Craib的干燥藤茎[3]，为广东、广西民间用于抗风湿的传统药，是广西壮族民间传统用药，有祛风除湿、消肿止痛[4]的作用，可用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎、坐骨神经痛、半身不遂和跌打肿痛。目前所检测到关于丁公藤药材的文献大多是对其进行含量测定，暂时没有利用指纹图谱[5]技术进行质量控制的研究。为控制和保证产品质量的稳定性，依据国家食品药品监督管理总局颁布的《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南（试行）》，本课题组对12批不同地区的丁公藤药材进行了特征图谱分析和相似度的计算，该方法能够从整体上控制丁公藤药材的质量，达到鉴别真伪[6-7]、评定药材优劣的目的，可为药材的质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

L-2000型高效液相色谱（HPLC）仪，包括G1311A型四元梯度泵、WLJYQ型进样器、G1315A型二极管阵列检测器（日本日立公司）；KQ-100A型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；GM-0.33A型无油真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）；1810-B型石英自动双重纯水蒸馏器（江苏宏华仪器厂）；BSA224S型电子天平（德国赛多利斯集团）。

1.2 试剂

绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号:110753-200413，纯度≥99%）；东莨菪苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号:20120910，纯度≥99%）；东莨菪内酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号:110768-200504，纯度≥99%）；甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

所有药材样品均经过辽宁医学院药学院生药科承伟教授鉴定，为旋花科植物丁公藤E.obtusfolia Benth或光叶丁公藤E.schmidtii Craib的干燥藤茎。样品来源详见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil ODS C18（200mm×4.6mm，5 μm）；流动相:乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），采用梯度洗脱，梯度洗脱程序详见表2；流速:1.0ml/min；检测波长:347nm；柱温:30 ℃；进样量:20μl。在上述色谱条件下，理论板数以绿原酸峰计，不低于3000，分离度大于1.5。

2.2 溶液的制备

表1 样品来源Tab 1 Samples’origins

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution programs

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取东莨菪苷[8]、东莨菪内酯[9-10]、绿原酸[11]对照品3.60、3.99 、4.12mg，分别配制成每1ml含0.360、0.399、0.412mg的对照品溶液。再分别精密量取上述3种溶液各2.5ml，置于25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成东莨菪苷、东莨菪内酯和绿原酸质量浓度分别为0.0360、0.0399、0.0412mg/ml的混合对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液 称取丁公藤药材细粉（过四号筛）约2.5 g，置于具塞锥形瓶中，放置过夜，称定质量，超声（功率:100 W，频率:40 kHz）提取30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，以半径为3 cm、3500 r/min离心10min，定容于25ml量瓶中，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 参照峰的选择

精密量取“2.2”项下供试品溶液（批号:110501）和混合对照品溶液各20μl，注入HPLC仪，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，详见图1。丁公藤药材经HPLC分析出现多个色谱峰，以绿原酸色谱峰（S）作为参照峰。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液20μl，按“2.1”项下色谱条件连续测定6次，记录各共有色谱峰的保留时间和峰面积。结果，东莨菪苷、东莨菪内酯和绿原酸的峰面积的RSD分别为1.33%、0.96%、1.85%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.4.2 稳定性试验 取同一批次丁公藤药材（批号:110501）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件，分别于配制0、2、4、8、16、24h时进行测定。结果，东莨菪苷、东莨菪内酯和绿原酸的峰面积的RSD分别为2.12%、1.35%、1.41%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品（批号:110501）；3.东莨菪苷；4.绿原酸；6.东莨菪内酯Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample（lot No.110501）；3.scopolamine glycosides；4.chlorogenic acid；6.scopoletin

2.4.3 重复性试验 取同一批次丁公藤药材（批号:110501）适量，按“2.2.2”方法制备供试品溶液6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，东莨菪苷、东莨菪内酯和绿原酸峰面积的RSD分别为0.21%、1.35%、1.87%，表明本方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.4.4 特征图谱的建立及评价 取12批不同产地的丁公藤药材各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。根据12批样品特征图谱的特点，可以确定10个峰作为共有特征峰，并标定了其中的3个色谱峰，其中3号峰为东莨菪苷峰，4号峰为绿原酸峰，6号峰为东莨菪内酯峰，这3个峰分离度较好，保留时间适宜，因此可以作为参照峰（东莨菪苷峰、绿原酸峰、东莨菪内酯峰是丁公藤药材的有效成分，后来含量测定测的就是东莨菪苷、绿原酸和东莨菪内酯的含量。“2.3”项中“以绿原酸色谱峰（S）作为参照峰”，这是选择峰面积最大的绿原酸峰作为参考来标定10个峰的），色谱见图1（B）。将各批丁公藤药材的特征图谱信号导入国家药典委员会主持开发的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版）》，计算生成对照特征图谱，12批药材特征图谱的共有模式详见图2，共有峰的相对保留时间和相对峰面积值详见表3，并计算对照图谱和12批样品图谱之间的相似度数据，相似度计算结果详见表4。相似度在0.90以上认为符合要求，为推荐品；0.90以下的为非推荐品。结果发现，第7批和第11批样品相似度小于0.90，不推荐使用。

3 讨论

3.1 提取方法的选择

试验中考察了100%、50%甲醇超声提取法和100%、50%乙醇超声提取法[12]及100%乙醇的加热回流提取方法。结果表明，100%甲醇超声提取法中大部分峰能在色谱图中真实体现，故选此法。

3.2 检测波长的选择

图2 12批丁公藤药材的特征图谱Fig 2 Fingerprint of 12 batches of E.obtusifolia

对丁公藤的甲醇超声提取液进行全波长扫描，结果最大吸收波长在299、347nm处。分别以254、299、326、347nm为检测波长，记录色谱图，结果在347nm波长下的色谱图中出峰数目较多，且各峰信号大小比较均匀，分离度较好。综合考虑，选择347nm作为丁公藤药材特征图谱的检测波长。

3.3 流动相的选择

试验分别以甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相系统进行梯度洗脱，记录色图谱。结果显示，以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，特征峰出现时间较晚，且峰形稍有拖尾；为使避免峰型拖尾，在有机相乙腈中加入0.1%的磷酸，可以看出谱图特征峰出现时间适宜，且峰形明显较好、分离度好、基线漂移小，因此以乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相，在347nm处进行检测，能获得很好的分离效果。

表3 12批样品特征图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积值Tab 3 Relative retention time and relative peak area of common peaks of characteristic spectrum of 12 batches of samples

表4 12批药材HPLC特征图谱相似度分析结果Tab 4 Result of similarity analysis of fingerprints of 12 batches of samples

本试验对不同产地的12批丁公藤药材进行了特征图谱研究[13]，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版）》进行分析，得到了丁公藤药材的对照用特征图谱，以及12批药材相对于对照特征图谱的相似度。结果表明，本方法简便、准确、重复性好，可为有效地控制丁公藤药材的内在质量标准提供科学依据。

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