复方王不留行片的质量标准研究

赵建颖，卢晓梅，李亮亮，许明哲（洛阳市食品药品检验所，河南 洛阳 471023）

复方王不留行片是由王不留行、邻氨基苯甲酸、干酵母、乳酸钙组成的复方制剂，具有增强体质、通经活血、散结、下乳、消肿、消痈的功效，临床上用于产后气血亏损、乳汁不通不下或乳少及乳痛、乳肿等症。国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第十四册WS-10001-（HD-1369）-2003未对方中主药王不留行进行质量控制，文献报道[1]仅见方中王不留行薄层色谱（TLC）鉴别方法，未见王不留行中王不留行黄酮苷的含量测定方法。为了有效地控制产品质量，笔者建立了TLC法对王不留行进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定方中邻氨基苯甲酸及王不留行黄酮苷的含量。

1 材料

1.1 仪器

U3000型HPLC仪，包括LPG-3400SD型泵、WPS-3000SL型自动进样器、TCC-3000RS型柱温箱、VWD-3100型紫外检测器、Chromeleon色谱工作站（美国Dionex公司）；92SM-202-A-DR电子分析天平（瑞士Precisa公司）；UV-2401PC型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

复方王不留行片（白云山汤阴东泰药业有限责任公司，批号:130302、120606、130311、131104；焦作市博爱药业有限公司，批号:110621）。王不留行黄酮苷对照品（批号:111853-201001，纯度:91.7%）、王不留行对照药材（批号:121094-200703）均购自中国食品药品检定研究院；邻氨基苯甲酸对照品（批号:C1305010，纯度:99.5%）购自上海晶纯生化科技股份有限公司；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；甲醇为色谱纯，磷酸、乙醇、无水乙醇、三氯化铝均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 王不留行的TLC鉴别

取本品，除去糖衣，粉碎，取粉末适量（约相当于王不留行1.0 g），置于锥形瓶中，加70%甲醇40ml，超声（功率:200 W，频率:40 kHz）处理30min，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。另取王不留行对照药材1 g，照上述供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。再取王不留行黄酮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。再取“2.2.2”项下缺王不留行的阴性样品适量，照上述供试品溶液的制备方法制成缺王不留行的阴性样品溶液。按TLC法[2]试验，吸取上述4种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以无水乙醇-水（4∶6，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，采用2%三氯化铝乙醇溶液浸渍法显色，热风吹干，置紫外光灯（365nm）下检视。结果，供试品溶液中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，缺王不留行的阴性样品无干扰，详见图1。

图1 薄层色谱图1～3、7～8.5批样品；4.王不留行黄酮苷对照品；5.王不留行对照药材；6.缺王不留行的阴性样品Fig 1 TLC chromatograms1-3，7-8.test sample；4.reference substance of vaccarin；5.reference substance of Vaccaria segetalis；6.negative sample without V.segetalis

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱:YMC-Pack Pro C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相:甲醇为流动相A，0.3%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，程序详见表1；流速:1.0ml/min；检测波长:280nm；柱温:35 ℃；进样量:10μl。

2.2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液。精密称取王不留行黄酮苷对照品30.38mg，置于50ml量瓶中，用70%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为王不留行黄酮苷对照品贮备液。再精密称取邻氨基苯甲酸101.08mg，置于50ml量瓶中，再精密量取上述王不留行黄酮苷对照品贮备液5ml，置于同一50ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。（2）供试品溶液。取样品40片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于王不留行1.0 g），置于50ml量瓶中，加70%甲醇30ml，超声（功率:200 W；频率:40 kHz）处理30min，放置至室温，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。（3）阴性对照溶液。按处方比例分别称取除邻氨基苯甲酸、王不留行外的其余各成分，按制备工艺分别制成缺邻氨基苯甲酸、王不留行的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法，制成缺邻氨基苯甲酸、王不留行的阴性对照溶液。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Program of the linear gradient elution

2.2.3 系统适用性试验 精密吸取“2.2.2”项下的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，供试品溶液中邻氨基苯甲酸和王不留行黄酮苷能达到基线分离，理论板数以王不留行黄酮苷计不低于5500，分离度＞9.2；阴性对照溶液无干扰。色谱见图2。

图2 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.缺王不留行的阴性对照；D.缺邻氨基苯甲酸的阴性对照；1.邻氨基苯甲酸；2.王不留行黄酮苷Fig 2 HPLC chromatogramsA.mixed reference；B.test sample；C.negative sample without V.segetalis；D.negative sample without anthranilic acid；1.anthranilic acid；2.vaccarin

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液1、3、5、7、10、20μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y王不留行黄酮苷＝21.56x－0.100（r＝0.9999）；y邻氨基苯甲酸＝3.755x+1.296（r＝0.9999）。结果表明，王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸的进样量分别在0.0557～2.2287、2.0114～40.2279μg范围内与各自峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10μl，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次。结果，王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸的峰面积的RSD分别为0.97%、0.38%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取供试品（批号:130302）溶液适量，分别于配制0、2、6、8、12h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸峰面积的RSD分别为0.86%、0.79%（n＝6），表明供试品溶液12h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取同一批样品（批号:130302）适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果，样品中王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸的平均含量分别为1.0102、32.016mg/g，RSD分别为1.01%、0.68%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（批号:130302）细粉适量（约相当于王不留行0.5 g），共6份，分别置于50ml量瓶中，分别加入邻氨基苯甲酸对照品约50mg、“2.2.2”项下王不留行黄酮苷对照品贮备液3.0ml，加70%甲醇30ml，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定并计算加样回收率，结果详见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.9 样品含量测定 取5批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条进行测定，以外标法计算，结果详见表3。

表3 样品含量测定结果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

精密称取王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸对照品各适量，用70%甲醇配制成适宜浓度的溶液，照紫外-可见分光光度法在200～400nm范围内扫描吸收光谱。结果表明，王不留行黄酮苷在280nm波长处有最大吸收，邻氨基苯甲酸在217、243nm波长处均有最大吸收。由于处方中王不留行黄酮苷的含量相对较低，为使两种成分都有较好的响应，故选择280nm作为检测波长。

3.2 流动相的筛选

参考相关文献[1-8]，本试验比较了多种流动相系统，分离效果均不理想。最终选用甲醇-0.3%磷酸溶液作为流动相，通过优化，使样品中邻氨基苯甲酸与王不留行黄酮苷色两组分达到基线分离，阴性对照样品无干扰，且各组分分离度良好，峰形佳。

3.3 耐用性考察

本文考察了YMC-Pack Pro C18（250mm×4.6mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）、Thermo Syncronis C18（150mm×4.6mm，5 μm）等色谱柱对目标化合物分离度和含量测定结果的影响。结果表明，3个不同厂家的同类型色谱柱对样品含量测定结果没有显著影响，含量测定RSD＜2.8%，分离度均＞3.4。

3.4 TLC鉴别中展开系统和温度的考察

笔者曾采用甲醇-水（4∶6，V/V）、甲醇-水（1∶1，V/V）等展开系统对方中王不留行进行TLC鉴别，但阴性对照样品均有干扰，效果不佳。最终采用无水乙醇-水（4∶6，V/V）的展开系统，该方法阴性对照样品无干扰，斑点清晰，分离度好。试验中笔者还发现，温度对样品的分离度有较大影响，温度高时阴性样品干扰大，斑点分离度差，因此TLC鉴别时应控制温度在20℃以下。

3.5 含量测定结果分析

由本研究结果可知，不同厂家样品中王不留行黄酮苷的含量相差极大，且低于2010年版《中国药典》（一部）[1]中对王不留行药材最低限量（0.40%）的规定。分析原因，主要是由于原质量标准中无王不留行质量控制，厂家投料用饮片含量差异所致。为了更好地控制复方王不留行片的质量，保证用药安全、有效，有必要建立王不留行黄酮苷的含量控制标准。

综上所述，该方法操作简便、快捷，结果准确、重复性好，可作为复方王不留行片的质量控制方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:49、附录ⅥB.

[2]王玉霞，殷永伟，耿琴.HPLC测定肾石通颗粒中王不留行黄酮苷的含量[J].数理医药学杂志，2012，25（5）:557.

[3]韩晋，李娜，刘冬，等.复方灵芝乳膏中王不留行黄酮苷含量测定方法研究[J].解放军药学学报，2012，28（5）:415.

[4]孟贺，陈玉平，秦文杰，等.HPLC测定王不留行中王不留行黄酮苷的含量[J].中国中药杂志，2010，35（16）:2072.

[5]张辉，陈乃江.HPLC法测定复方王不留行片中邻氨基苯甲酸的含量[J].现代中药研究与实践，2009，23（4）:63.

[6]王小雪，郑文捷，谢国祥，等.高效毛细管电泳同时测定板蓝根中水杨酸、丁香酸、苯甲酸和邻氨基苯甲酸[J].中国中药杂志，2009，34（2）:189.

[7]方建国，万进，汤杰，等.大孔吸附树脂分离纯化大青叶有机酸部位的实验研究[J].中国药房，2007，18（16）:1214.

[8]王文清，张飞，方建国，等.反相高效液相色谱法测定大青叶中邻氨基苯甲酸与丁香酸的含量[J].医药导报，2005，25（5）:456.